菊花CmNRTs基因的克隆及功能鑒定.pdf

1、菊花(Chrysanthemum grandiflorum(Ramat.) Kitam.）是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，但切花菊設(shè)施周年生產(chǎn)過程中，普遍存在氮肥過度施用、氮肥利用率低和氮素?fù)p失嚴(yán)重等問題，嚴(yán)重影響切花產(chǎn)量與品質(zhì)，并導(dǎo)致水系統(tǒng)富營(yíng)養(yǎng)化及土壤次生鹽漬化。目前，有關(guān)菊花氮素營(yíng)養(yǎng)研究還僅限于氮素水平/形態(tài)對(duì)其生長(zhǎng)影響。菊花硝態(tài)氮運(yùn)輸分子機(jī)制研究可以為氮素高效利用，提高切花菊產(chǎn)量與品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。本研

2、究包括:從16個(gè)南農(nóng)系列切花品種中篩選出氮高效吸收切花菊品種‘南農(nóng)雪峰’;克隆了CmNRT2家族7個(gè)基因，命名為CmNRT2.1-2.7，并克隆了CmNRT1.1基因和CmNAR2.1基因;通過TAIL-PCR結(jié)合Anchored-PCR方法克隆了CmNRT2.1、CmNRT2.4、CmNRT1.1和CmNAR2.1基因的啟動(dòng)子;利用GeNorm軟件分析菊花中穩(wěn)定的內(nèi)參基因，發(fā)現(xiàn)psaA基因在生物脅迫和非生物脅迫下都相對(duì)穩(wěn)定;通過qRT

3、-PCR方法研究了菊花CmNRT基因的表達(dá)特性;通過泛素分裂化系統(tǒng)酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)CmNAR2.1和CmNRT2.1、CmNRT2.4存在互作關(guān)系;超表達(dá)CmNAR2.1、CmNRT2.1和CmNRT2.4基因，對(duì)擬南芥生理指標(biāo)及根系形態(tài)的分析;構(gòu)建RNAi干擾載體轉(zhuǎn)化切花菊‘神馬’，獲得轉(zhuǎn)基因株系，主要研究結(jié)果如下:
　　 1.以本實(shí)驗(yàn)室自主選育的16個(gè)南農(nóng)系列切花菊品種為試驗(yàn)材料，利用石英砂為基質(zhì)進(jìn)行砂培，

4、營(yíng)養(yǎng)液為改良的休伊特營(yíng)養(yǎng)液（大量）加Arnon營(yíng)養(yǎng)液（微量），通過對(duì)植株澆灌低氮水平營(yíng)養(yǎng)液(16 mg/L)和正常氮水平營(yíng)養(yǎng)液(320 mg/L)，3周之后測(cè)定植株干重，葉綠素含量和全氮量，通過比較相對(duì)干物質(zhì)重，相對(duì)含氮量和相對(duì)葉綠素含量，初步確定‘南農(nóng)小麗’、‘南農(nóng)雪峰’和‘南農(nóng)玉珠’為氮利用效率相對(duì)較高的品種，‘南農(nóng)霞光’、‘南農(nóng)宮粉’、‘南農(nóng)花臉’為氮利用效率較低的品種。仍然以相對(duì)干物質(zhì)重，相對(duì)含氮量和相對(duì)葉綠素含量為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)

5、一步進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)復(fù)篩，比較初篩的6個(gè)品種，最終確定1個(gè)氮高效利用品種‘南農(nóng)雪峰’和1個(gè)氮低效利用品種‘南農(nóng)宮粉’。
　　 2.以‘南農(nóng)雪峰’為研究材料，利用兼并引物RT-PCR和RACE-PCR方法分離出7個(gè)CmNRT2基因家族成員，命名為CmNRT2.1-2.7。同時(shí)擴(kuò)增了CmNRT2基因家族成員的基因組DNA序列。利用DNAman軟件及MatGAT2.01程序?qū)易宄蓡T氨基酸序列進(jìn)行相似性比較及進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)CmNRT2.

6、5和CmNRT2.7與其它5個(gè)成員氨基酸差異性較大。利用相同方法克隆獲得2個(gè)CmNRT類基因的cDNA全長(zhǎng)，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對(duì)命名為CmNRT1.1和CmNAR2.1。CmNRT1.1基因編碼587個(gè)氨基酸，CmNAR2.1基因編碼199個(gè)氨基酸，分別對(duì)兩個(gè)基因做了氨基酸序列同源性比對(duì)和聚類分析，發(fā)現(xiàn)CmNRT1.1蛋白與雙子葉植物大豆(GmNRT1.1-like)進(jìn)化關(guān)系上最接近，CmNAR2.1蛋白與雙子葉植物擬南芥(A

7、tNAR2.1、AtNAR2.2)，百脈根(LjNAR2.1)和黃瓜(CsNAR2)的等聚為一個(gè)亞群。這些表明，我們分離的CmNRTs基因?yàn)橄跛猁}轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。
　　 3.利用TAIL-PCR結(jié)合Anchored PCR方法從菊花基因組中克隆獲得了CmNRT1.1、CmNRT2.1、CmNRT2.4和CmNAR2.1（CmNRT3.1）基因上游啟動(dòng)子序列，長(zhǎng)度分別為1096 bp、1658 bp、1413 bp和1683 bp，

8、并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)CmNRTs基因的上游啟動(dòng)子序列中除含有典型的真核生物核心啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)外，還包含硝酸鹽誘導(dǎo)的調(diào)控元件、氮代謝調(diào)控元件以及多個(gè)脅迫響應(yīng)和激素應(yīng)答相關(guān)的調(diào)控元件，同時(shí)啟動(dòng)子間還包含許多相同的調(diào)控元件，表明基因可能受到共同調(diào)控。
　　 4.利用geNorm軟件評(píng)估了菊花中8個(gè)候選內(nèi)參基因在生物脅迫和非生物脅迫下的穩(wěn)定性，八個(gè)候選內(nèi)參基因分別為:tubulin(alpha-2，4 tubulin)

9、、actin、EF1α(elongation factor1α)、UBC(ubiquitin C)、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)、psaA(photosynthesis-related plastid gene representing photosystem I)、PP2Acs(catalytic subunit of protein phosphatase2A)和PGK

10、(phosphoglycerate kinase)。廣泛使用的EF1α基因在蚜蟲脅迫下表現(xiàn)穩(wěn)定，但是澇脅迫下不穩(wěn)定。PP2Acs基因?yàn)樵跓崦{迫下和澇害脅迫下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因之一，但在蚜蟲脅迫下最不穩(wěn)定。在三種脅迫下，常用的actin基因都不是最穩(wěn)定的。psaA基因在生物脅迫和非生物脅迫下都相對(duì)穩(wěn)定。
　　 5.利用熒光定量PCR方法對(duì)CmNRT2.1、CmNRT2.4和CmNAR2.1基因的表達(dá)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，CmNR

11、T2.1、CmNRT2.4和CmNAR2.1均受硝酸鹽誘導(dǎo)型表達(dá)，其中CmNAR2.1、CmNRT2.4為組成型誘導(dǎo)型表達(dá)基因。銨鹽作為植物體另一種氮源，可以誘導(dǎo)CmNRT2.1和CmNRT2.4的表達(dá)，但會(huì)抑制CmNAR2.1的表達(dá)。谷氨酰胺作為另一種還原性氮，能抑制硝酸鹽對(duì)CmNRT2.1、CmNRT2.4和CmNAR2.1的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 6.構(gòu)建了酵母表達(dá)載體pBT3-C-CmNAR2.1和pPR3-N-CmNRT2.

12、1、pPR3-N-CmNRT2.4，利用分裂泛素化系統(tǒng)證明了CmNAR2.1與CmNRT2.1、CmNRT2.4互作。為驗(yàn)證酵母實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行了BiFC（bimolecular fluorescence complementation雙分子熒光互補(bǔ)）實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明CmNAR2.1與CmNRT2.1、CmNRT2.4之間確實(shí)存在互作關(guān)系。在分析CmNAR2.1和OsNAR2.1、AtNAR2.1、HvNAR2.3氨基酸序列的基礎(chǔ)上，將Cm

13、NAR2.1進(jìn)行氨基酸分段，初步證明了153-199氨基酸是CmNAR2.1和CmNRT2.4互作的關(guān)鍵區(qū)域，這些初步證明菊花中協(xié)同作用蛋白CmNAR2.1可以輔助高親和運(yùn)輸?shù)鞍證mNAR2.1和CmNRT2.4運(yùn)輸硝酸鹽。
　　 7.構(gòu)建了植物正義表達(dá)載體pCAMBIA1301-220-CmNAR2.1和pCAMBIA1301-220-CmNRT2.1、pCAMBIA1301-220-CmNRT2.4載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化

14、野生型擬南芥(Col-0)，通過潮霉素抗性、GUS染色、RT-PCR、qRT-PCR篩選鑒定陽性苗，每個(gè)基因選取兩個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)量高的株系（T3代）進(jìn)一步分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)CmNRT2.1和CmNRT2.4基因擬南芥地上部鮮重，地下部鮮重以及地上部鮮重與地下部鮮重比值均高于野生型擬南芥;兩個(gè)CmNRT2.1轉(zhuǎn)基因株系的地上部，地下部硝酸鹽含量均高于野生型;但是35S:CmNRT2.4-3株系的地上部，地下部硝酸鹽含量高于野生型，35S:C