菊花CmMYB1和CmMYB2轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及功能鑒定.pdf

1、植物通過轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控目的基因的表達來調(diào)控其生長發(fā)育及生理代謝。MYB轉(zhuǎn)錄因子是最大的植物轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與植物次生代謝調(diào)控、激素和環(huán)境脅迫的應(yīng)答，并對細胞分化和植物葉片等器官的形態(tài)建成起重要的調(diào)控作用。菊花原產(chǎn)我國，是我國十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，具有很高的觀賞和應(yīng)用價值，在花卉生產(chǎn)中占有十分重要的地位。但菊花新基因的發(fā)掘和分子育種方始起步，本研究以菊花為研究材料，從中分離克隆出新的MYB轉(zhuǎn)錄因子，以期為MYB轉(zhuǎn)錄

2、因子在植物次生代謝調(diào)控及其脅迫應(yīng)答等方面的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.根據(jù)菊花EST文庫篩選出2個MYB基因同源片段，據(jù)此設(shè)計基因特異引物，以自主選育的盆栽多頭菊品種‘鐘山紫桂’葉片為材料，通過3'、5'RACE-PCR分別得到全長為1，237 bp和1，331 bp的菊花MYB基因cDNA序列CmMYB1(JF795917)和CmMYB2(JF795918);其中CmMYB1具有一個846 bp的OR

3、F，編碼281個氨基酸及95 bp的5'非編碼區(qū)和296bp包含了多聚A尾的3'非編碼區(qū);CmMYB2具有一個948 bp的ORF，編碼315個氨基酸及86 bp的5'非編碼區(qū)和297 bp包含了多聚A尾的3'非編碼區(qū)。氨基酸序列比對表明，這2個基因均具有兩個MYB結(jié)構(gòu)域，為典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，其中CmMYB1基因?qū)儆诘?亞群成員，而CmMYB2基因?qū)儆诘?2亞群成員。以基因組DNA為模板對CmMYB1和CmMYB2進行

4、PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)序列分析表明，CmMYB1含有1個307 bp的內(nèi)含子，而CmMYB2不含內(nèi)含子。
　　 2.克隆了CmMYB1、CmMYB2基因的啟動子序列并發(fā)現(xiàn)了一些與ABA及脅迫相關(guān)的作用元件。
　　 3.構(gòu)建2個酵母效應(yīng)質(zhì)粒pGBKT7-CmMYB1和pGBKT7-CmMYB2，轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2H中，并分別在缺陷培養(yǎng)基SD/-Trp上篩選后轉(zhuǎn)入SD/-His-Ade上培養(yǎng)，結(jié)果表明，CmMYB1和CmMYB

5、2均無明顯的轉(zhuǎn)錄激活功能。
　　 4.熒光定量PCR結(jié)果表明，CmMYB1和CmMYB2基因在菊花的根、莖、葉和花的5個發(fā)育階段都有表達，且在莖中的表達量最高，CmMYB1在葉片和花的完全著色與初開期時表達量較高，在根中表達較低;CmMYB2基因在葉中表達量也較高，但在根和開花的各個時期表達量均較低。脅迫應(yīng)答的檢測結(jié)果顯示，在高鹽、干旱(PEG)、低溫和ABA誘導(dǎo)條件下，CmMYB2的表達量在處理后1h均有所增加，而CmMYB1

6、的表達量除了在低溫脅迫下略有上升外，其他脅迫條件下均較低。
　　 5.構(gòu)建綠色熒光蛋白融合表達載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞進行瞬時表達，結(jié)果表明，CmMYB1、CmMYB2蛋白位于細胞核中。
　　 6.構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA1301-CmMYB1和pCAMBIA1301-CmMYB2，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥(Col-0)，通過潮霉素抗性、GUS染色及RT-PCR篩選鑒定陽性苗。轉(zhuǎn)CmMYB1植株和野生型

7、植株在表型上沒有區(qū)別;qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，CmMYB1降低木質(zhì)素合成途徑以及由總苯丙氨酸途徑通往木質(zhì)素合成途徑的關(guān)鍵酶基因AtCAD（cinnamyl alcohol dehydrogenase，肉桂醇脫氫酶）、AtCOMT（caffeic acido-methyl-transferase，咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶）、AtC4H（cinnamate4-hydroxylase，肉桂酸-4-羥基酶）和At4CL1（4-coumarat

8、e-CoA ligase，4-香豆酸:輔酶A連接酶）的表達，結(jié)果在CmMYB1表達的擬南芥中，木質(zhì)素含量降低。轉(zhuǎn)CmMYB2植株較野生型開花延遲，葉片數(shù)目增多，耐脅迫檢測結(jié)果表明，CmMYB2在擬南芥中的過表達，增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱和鹽脅迫的耐受性;qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，過表達CmMYB2擬南芥中RD22、RD29A、RAB18、COR47、ABA1扣ABA2等脅迫相關(guān)基因的表達量增強;此外，CO（CONSTANS）、FT（F