巴西橡膠樹(shù)HbWRKY1轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、WRKY是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族,參與植物的抗逆脅迫和衰老等生理生化過(guò)程,病原菌侵染、機(jī)械傷害和植物激素類(lèi)物質(zhì)刺激(如乙烯利、茉莉酸、水楊酸)等均能誘導(dǎo)WRKY基因的表達(dá)。巴西橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)是天然橡膠的主要來(lái)源?？寺∠鹉z樹(shù)WRKY基因,研究其在橡膠樹(shù)中潛在的生物學(xué)功能,對(duì)深入了解橡膠樹(shù)抗逆以及與割膠傷害有關(guān)分子特征,具有重要的意義。
　　 獲得研究結(jié)果:
　　 1、通過(guò)篩選已

2、構(gòu)建的乙烯利刺激條件下巴西橡膠樹(shù)膠乳與未處理膠乳差異表達(dá)的cDNA消減文庫(kù),我們獲得了一個(gè)與WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有較高同源性的EST序列HbEST125;結(jié)合RACE和RT-PCR技術(shù),從巴西橡膠樹(shù)中首次克隆了一個(gè)編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因,命名為libWRKYI(GenBank登錄號(hào):GU372969)。
　　 2、生物信息學(xué)分析表明,該基因全長(zhǎng)cDNA含有1234個(gè)核苷酸,包含一個(gè)912 bp的完整開(kāi)放閱讀框序列(ORF),編

3、碼一個(gè)含有303個(gè)氨基酸殘基的多肽。推導(dǎo)氨基酸序列含有一個(gè)與其它植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子一致的WRKY高度保守的氨基酸序列,在其C端還有一個(gè)由兩個(gè)半胱氨酸和兩個(gè)組氨酸組成的鋅指結(jié)構(gòu),由此可以判定HbWRKY1屬于WRKY家族中的第Ⅱ類(lèi);推導(dǎo)氨基酸序列與蓖麻(Ricinus communis,EEF47235)、白楊(Populus tremula x Populus alba.ABK41486)和大豆(Glycine max,ABC2692

4、0)相應(yīng)的WRKY同源性分別高達(dá)79％、73％和58％。
　　 3、利用Genome Walking技術(shù),從巴西橡膠樹(shù)葉片基因組DNA中克隆得到HbWRKY1基因1377 bp的5'端調(diào)控序列(GenBank登錄號(hào):GU372970)。序列分析顯示,該片段除了含有一個(gè)典型的核心啟動(dòng)子區(qū)域外,還含有多個(gè)TATA-box、CAAT-box等啟動(dòng)子元件以及多種與激素和脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的順式調(diào)控元件,這暗示HbWRKY1轉(zhuǎn)錄因子可能參與了橡

5、膠樹(shù)逆脅迫、激素響應(yīng)的調(diào)控。
　　 4、利用半定量RT-PCR技術(shù)研究了HbWRKY1的表達(dá)特征。結(jié)果顯示,HbWRKY1在巴西橡膠樹(shù)中里組成型表達(dá),但具有明顯的組織差異性,其在膠乳中大量表達(dá),花中次之,樹(shù)皮、根和樹(shù)葉中少量表達(dá);ET、JA和機(jī)械傷害能夠誘導(dǎo)HbWRKY1在膠乳中的表達(dá);干旱、ABA和白粉病侵染明顯誘導(dǎo)HbWRKY1在葉片中的表達(dá)。
　　 5、成功構(gòu)建了HbWRKY1過(guò)量表達(dá)的植物表達(dá)載體pCAMBIA1

6、304-HbWRKY1,通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法獲得了65株轉(zhuǎn)基因煙草。干旱脅迫試驗(yàn)證實(shí),HbWRKY1的過(guò)量表達(dá)可以明顯提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱脅迫的耐受能力,但機(jī)械傷害、高溫脅迫等對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株的影響差異不明顯。
　　 結(jié)論:HbWRKY1在巴西橡膠樹(shù)中呈組成型表達(dá),但具有明顯的組織差異性,其在膠乳中大量表達(dá),花中次之,樹(shù)皮、根和樹(shù)葉中少量表達(dá):ET、JA和機(jī)械傷害能夠誘導(dǎo)HbWRKY1在膠乳中的表達(dá);干旱、ABA