巴西橡膠樹HbEBP1基因表達及其功能研究.pdf

1、橡膠樹是多年生熱帶作物,常規(guī)育種周期很長,選育一個大規(guī)模推廣的良種,一般要25～30年時間,且入選率很低,僅千分之幾。在橡膠生產(chǎn)上,非生物脅迫嚴重影響了橡膠的產(chǎn)量,特別是低溫、干旱。如何利用植物分子生物學(xué)技術(shù),從橡膠樹的基因上入手,通過基因功能的鑒定,發(fā)掘能夠改善橡膠樹性狀的相關(guān)基因,再和常規(guī)育種相結(jié)合,快速培育出既能速生又能抵御寒害、早害的新品種,已成為育種的新目標(biāo)。
　　 本研究利用從已經(jīng)構(gòu)建好橡膠樹的低溫誘導(dǎo)全長cDNA文

2、庫中篩選出的HbEBP1(ErbB-3 binding protein1)基因,對其進行了序列分析、功能預(yù)測、表達模式分析以及轉(zhuǎn)化擬南芥的功能鑒定,主要結(jié)果如下:
　　 1.獲得的巴西橡膠樹HbEBP1基因cDNA序列總長為1462bp,其中5'端非編碼區(qū)長度為141bp,3'端非編碼區(qū)長度為133bp。具有完整的閱讀框,編碼395個氨基酸,推導(dǎo)的HbEBP1蛋白分子量為43.596kD,等電點為6.45。
　　 2.生

3、物信息學(xué)分析表明:巴西橡膠樹HbEBP1基因具有三個保守結(jié)構(gòu)域:增殖相關(guān)蛋白2G4(PA2G4-like)、氨肽酶M24(APP MetAP)、甲硫氨酸氨肽酶(MAP)結(jié)構(gòu)域。不存在信號肽,不是分泌蛋白;不含明顯的疏水區(qū);沒有跨膜結(jié)構(gòu),屬于非跨膜蛋白;定位于細胞質(zhì)與細胞核,預(yù)測具有信號傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)生長和脅迫應(yīng)答功能。
　　 3.成功構(gòu)建了(pGEX-6P-1)-HbEBP1原核表達載體,并在大腸桿菌BL21(DE3)
　　

4、 中進行了誘導(dǎo)表達,得到了GST-HbEBP1融合蛋白。誘導(dǎo)條件:0.1mMIPTG,37℃,誘導(dǎo)4個小時。對誘導(dǎo)后的GST-HbEBP1融合蛋白進行了純化,并對Map活性進行了測定,結(jié)果表明,HbEBP1基因雖然含有Map結(jié)構(gòu)域,但不具有Map活性。
　　 4.成功構(gòu)建了pXCS-HbEBP1-eGFP-HAStrep真核表達載體,轉(zhuǎn)化擬南芥,對HbEBP1蛋白的亞細胞定位進行了研究,結(jié)果表明HbEBP1蛋白定位于細胞質(zhì)與細胞

5、核,與生物信息學(xué)的預(yù)測相一致。
　　 5.分別在低溫、干旱及ABA等三種脅迫環(huán)境下對巴西橡膠樹中HbEBP1基因的表達模式進行研究,結(jié)果表明HbEBP1受低溫、干旱及ABA脅迫誘導(dǎo)表達。在受到脅迫的起始,反應(yīng)強烈,30分鐘內(nèi)表達量迅速上升,隨后開始下降,最后回升到一定水平并維持。巴西橡膠樹HbEBP1基因?qū)γ{迫非常敏感,能夠在很短的時間內(nèi)啟動轉(zhuǎn)錄和翻譯來響應(yīng)脅迫。
　　 6.將獲得的HbEBP1基因轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥。N