橡膠樹(shù)CBF信號(hào)通路相關(guān)基因的克隆表達(dá)及HbCBF1功能研究.pdf

1、在橡膠生產(chǎn)上，非生物脅迫嚴(yán)重影響了橡膠的產(chǎn)量，特別是低溫、干旱。近幾年來(lái)，利用植物分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)提高植物的抗寒、抗旱能力的研究進(jìn)展十分迅速。特別是，一類(lèi)能調(diào)節(jié)許多抗寒、耐旱和耐鹽相關(guān)基因COR(ColdResponsive)的轉(zhuǎn)錄激活因子CBF(CRT/DRE-BindingFactor)的研究甚多，它位于冷應(yīng)答調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)上，能激活下游眾多與抗逆有關(guān)的功能基因的表達(dá)。目前對(duì)CBF途徑的研究是眾多冷應(yīng)答途徑中最為透徹的，功能最為明確

2、的，也是植物抗寒分子育種目的基因的首選。本研究以巴西橡膠樹(shù)(HeveaBrasiliensis)為試驗(yàn)材料，通過(guò)同源克隆的方法，從冷處理的橡膠樹(shù)中分離到CBF冷應(yīng)答途徑上的幾個(gè)相關(guān)基因；對(duì)它們進(jìn)行了序列分析、功能預(yù)測(cè)、表達(dá)模式分析以及轉(zhuǎn)化擬南芥的功能鑒定，內(nèi)容概括如下： 1.利用間并引物進(jìn)行PCR，從巴西橡膠樹(shù)中克隆出兩個(gè)AP2/EREBP類(lèi)基因保守片斷.序列分析顯示，保守片斷1來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室已獲得的HbCBF1；片斷2則與擬南芥

3、AP2/EREBP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子有很高的同源性。 2.利用SAFA-PCR法成功獲得HbCBF2的啟動(dòng)子序列。通過(guò)預(yù)測(cè)分析，存在一條50bp的啟動(dòng)子序列，存在Gapbox2和I-box。 3.通過(guò)對(duì)巴西橡膠樹(shù)冷處理cDNA全長(zhǎng)文庫(kù)的序列篩選，獲得與抗寒、抗旱相關(guān)的基因HbDREB2B和HbRD22。 4.NorthernBlotting雜交實(shí)驗(yàn)顯示，HbCBF1、HbCBF2均能被低溫誘導(dǎo)表達(dá)，相比而言，.HbCBF

4、2被誘導(dǎo)的更為迅速；對(duì)于干旱脅迫，HbCBF1沒(méi)有應(yīng)答，說(shuō)明其參與冷應(yīng)答過(guò)程與干旱誘導(dǎo)途徑互為獨(dú)立；而HbCBF2則能迅速被脫水脅迫所誘導(dǎo)表達(dá);HbDREB2B能被低溫和干旱誘導(dǎo)，且表達(dá)豐度不受脅迫時(shí)間影響：HbRD22亦能被低溫和干旱誘導(dǎo)，能迅速增加表達(dá)量，但隨著脅迫時(shí)間的增長(zhǎng)，表達(dá)量隨之減少，甚至低于正常狀態(tài)下的表達(dá)豐度。表明同類(lèi)基因表達(dá)和功能具有多樣性。 5.篩選鑒定出一些HbCBF1轉(zhuǎn)化擬南芥的純系植株。通過(guò)Northe

5、rn雜交實(shí)驗(yàn)顯示，HbCBF1在組成型強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV35S驅(qū)動(dòng)下，能在正常生長(zhǎng)條件表達(dá)，并且能誘導(dǎo)擬南芥COR15a和RD29a基因的表達(dá)；在冷處理和干旱處理的情況下，HbCBF1的誘導(dǎo)效果則與擬南芥中內(nèi)源COR15a的表達(dá)途徑疊加：另一方面卻抑制了RD29a的表達(dá)。 6.測(cè)定了三個(gè)轉(zhuǎn)化株系的抗寒、抗旱相關(guān)生理指標(biāo)，結(jié)果顯示HbCBF1增強(qiáng)轉(zhuǎn)化植株的抗寒性，卻有可能限制了其抗旱能力. 綜上所述，非低溫馴化的巴西橡膠樹(shù)中