桑樹CBF1和BADH基因的克隆及分析.pdf

1、本試驗通過參考其它植物同源基因的保守區(qū)序列設計引物,以桑樹(育71-1)的扦插苗為試驗材料,克隆了桑樹CBF1轉(zhuǎn)錄因子基因、甜菜堿醛脫氫酶基因的cDNA全長序列,并對獲得序列進行了分析、表達和功能驗證等。研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1、桑樹CBF1轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆,表達分析及5'端啟動子序列的克隆與分析
　　本試驗利用RT-PCR和RACE技術克隆了桑樹CBF1基因的cDNA序列,命名為MCBF1,(GenBank登錄號JX

2、186750)。序列分析結(jié)果表明該基因序列全長為1134bp,包括693bp的開放閱讀框(ORF),87bp的5'UTR和354bp的3'UTR。生物信息學預測顯示其演繹的氨基酸序列具有AP2結(jié)構(gòu)域及其兩端的CBF家族特有的多肽序列,與其它植物CBF基因翻譯的氨基酸序列同源性較高。將構(gòu)建的pET28a-MCBF1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后,誘導表達的MCBF1重組蛋白分子量與預測大小基本一致。構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示:桑樹與柑橘(Citrusj

3、ambhiri)、垂枝樺(Betulapendula)和切花月季(Rosahybridcultivar)的親緣關系較近。半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),MCBF1基因在未經(jīng)過4℃處理的對照桑苗嫩葉中無表達,在4℃處理過的桑苗幼葉中均有表達,而在處理6天后相對表達量最高。通過染色體歩移法克隆了該基因起始密碼子上游約400bp的堿基序列,并利用在線軟件PLACE對其進行了分析。
　　2、桑樹甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因的cDNA全長克隆

4、及序列分析
　　從桑樹中克隆了甜菜堿醛脫氫酶基因的cDNA序列,命名為MBADH,(GenBank登錄號KC244769)。序列分析結(jié)果表明桑樹的BADH基因cDNA序列全長1883bp,可編碼501個氨基酸,蛋白分子量為54.6KD,等電點pI為5.19。氨基酸序列分析顯示,MBADH蛋白中具有與酶結(jié)合位點相關的十肽序列(VSLELGGKSP),同源分析表明BADH基因在桑樹與其它植物之間有很高的保守性。基于桑樹和其他18個物種