農(nóng)桿菌介導(dǎo)CBF1基因轉(zhuǎn)化大豆的初步研究.pdf

1、CBF是被低溫誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，它含有與DNA結(jié)合的AP2結(jié)合域，通過與低溫誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的CRT/DRE(C-repeat/DehydrationResponsiveElement)調(diào)控元件結(jié)合，誘導(dǎo)抗寒基因COR(cold-regulated)的表達(dá)，從而提高植物的抗寒性。另外CBF基因在抗旱抗鹽堿等方面也有一定的作用。大豆是較難轉(zhuǎn)化的作物之一，這主要是由于大豆組織培養(yǎng)再生困難、可重復(fù)性差、基因型之間差異大等原因造成。本試驗(yàn)的

2、目的是研究復(fù)合注射針介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法，并利用復(fù)合針介導(dǎo)法進(jìn)行CBF1基因轉(zhuǎn)化大豆的研究。
　　 通過對(duì)影響復(fù)合注射針刺傷大豆種子萌發(fā)率主要因素的研究發(fā)現(xiàn):無菌水浸泡大豆8h，復(fù)合注射針針刺1次和添加3mg/L的AgNO3時(shí)，大豆種子的萌發(fā)率最高，達(dá)到93.1％。農(nóng)桿菌侵染大豆的萌發(fā)率比沒有農(nóng)桿菌侵染的有了明顯的下降，從93.1％降至88.2％。
　　 為了研究復(fù)合注射針針刺大豆子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)率重要因素的影響，本試

3、驗(yàn)進(jìn)行了大豆萌發(fā)時(shí)間、復(fù)合注射針針刺次數(shù)及添加不同濃度AgNO3三個(gè)處理，得出了大豆子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)率最高的條件:即大豆萌發(fā)時(shí)間為5d，針刺1次和添加3mg/L的AgNO3。誘導(dǎo)率達(dá)到66.7％。農(nóng)桿菌侵染大豆的誘導(dǎo)率比沒有農(nóng)桿菌侵染的大豆有了明顯的下降，從66.7％降至47.0％。
　　 復(fù)合針介導(dǎo)下對(duì)大豆轉(zhuǎn)化CBF1基因進(jìn)行了研究:
　　 首先是載體構(gòu)建，先將pCAMBIA1301和PROK2進(jìn)行EcoRⅠ和Hind

4、Ⅲ雙酶切，將含有啟動(dòng)子和終止子片段連接到pCAMBIA1301，構(gòu)成pCAM-ROK2中間載體，然后通過KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切pCAM-ROK2和PROK2-CBF1再進(jìn)行連接，構(gòu)建成pCAM-ROK2-CBF1。該載體的T-DNA上具有潮霉素抗性基因、gus報(bào)告基因及CBF1基因。CBF1基因是由CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)。
　　 將農(nóng)桿菌浸染的半片種子在共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3-5d后，在無篩選劑的培養(yǎng)基上（含250mg/L的羧