根癌農桿菌介導的抗寒基因轉錄因子CBF轉化蘋果的研究.pdf

1、本研究以蘋果(MalusdomesticaBorkh)營養(yǎng)系砧木M26和栽培品種嘎拉試管苗為試驗材料，以農桿菌EHA105為媒介把目的基因——抗寒基因的轉錄因子CBF導入蘋果。通過對影響葉片、白化莖段離體再生不定芽和根癌農桿菌(Agrobacterium)EHA105介導的遺傳轉化效率的若干因素的研究，優(yōu)化了蘋果再生不定芽系統和遺傳轉化系統，并成功將CBF基因導入到了蘋果的基因組中。 主要研究結果如下： 1.蘋果不同外植

2、體再生不定芽能力不同，以白化莖段的再生效果優(yōu)于葉片。適宜蘋果白化莖段不定芽再生的體系為：繼代苗暗培養(yǎng)20天左右獲得白化莖段，取1～2節(jié)位的白化莖段切成0.5cm的小段，接種(平放)在MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2～3周就會有芽點出現。M26和Gala的不定芽再生效率均達到95﹪以上。 2.培養(yǎng)基中添加適宜濃度的BA(5.0mg/L)和TDZ(1.0mg/L)可使M26白化莖段不定芽再生達到較高的水平，但TDZ的使用會增加再生芽的玻璃化現

3、象，以5.0mg/L的BA用于M26白化莖段不定芽再生較為適宜。 3.白化莖段的褐化現象比葉片嚴重，在再生培養(yǎng)基中添加100mg/LVc可以抑制褐化現象的發(fā)生，1mg/L的AgNO3提高蘋果不定芽的再生效率；當Vc濃度超過400mg/L或AgNO3濃度超過3mg/L時，將抑制蘋果白化莖段不定芽的再生，且白化莖段傷口處褐化現象加重。 4.繼代苗苗齡對白化莖段不定芽的再生有很大影響：取自繼代培養(yǎng)20～25天的白化莖段上取材的

4、1～2節(jié)位的莖段，再生頻率最高。低于此苗齡白化莖因抽生太短不利于取材，而高于此苗齡，莖段分化率明顯降低，并且褐化現象加重。 5.在根癌農桿菌EHA105介導的遺傳轉化中，當以白化莖段和葉片為轉化材料時，有效的Km選擇壓分別為12mg/L和10mg/L；適宜的頭孢霉素濃度為200mg/L。 6.乙酰丁香酮(AS)可以誘導vir區(qū)基因的表達，促進T-DNA的轉移，在侵染液和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加30μmol/L的AS可以提高蘋果

5、的基因轉化效率。 7.通過對影響農桿菌介導轉化的各種因素進行篩選，得到了一條最佳的轉化途徑：外植體在分化培養(yǎng)基上預培養(yǎng)1天；農桿菌活化至對數生長期，菌液濃度為OD600=0.6左右；侵染外植體10min；共培養(yǎng)2天；然后脫菌、選擇同時進行。 8.共有12個轉化株系通過了卡那霉素抗性檢測，具體包括三個方面：①轉化株在附加卡那霉素50mg/L的繼代培養(yǎng)基上能夠連續(xù)增殖繼代，②轉化株葉片在附加卡那霉素30mg/L的分化培養(yǎng)基上