農(nóng)桿菌介導(dǎo)百子蓮抗寒基因CBF1高效轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、百子蓮是世界著名鮮切花和綠地植物之一，在花卉市場中占有重要的位置，但是，由于百子蓮是引自非洲的一種熱帶花卉，抗寒性比價差，如何增強(qiáng)百子蓮的抗寒性來增大其利用價值成為急需解決的實際問題。最近幾年，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，為百子蓮育種提供了新的思路。
　　 本試驗以野生型擬南芥基因組DNA為模板，克隆ATCBF1全長基因，然后將其插接到pMD18-T中，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌本DH5a菌株中。然后提取pMD18-T質(zhì)粒和pCAMBIA1304進(jìn)

2、行雙酶切，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。經(jīng)測序檢測后，目的基因被克隆到質(zhì)粒中，位于CaMV35S啟動子后的NcoI和BgiⅡ酶切位點間，構(gòu)建CBF1的植物表達(dá)載體，接著將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。
　　 百子蓮抗性植株篩選試驗，根據(jù)百子蓮的胚性愈傷組織和去根幼苗在含有0mg/L,5mg/L,10mg/L,15mg/L,20mg/L,25mg/L六個潮霉素濃度的分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中的分化成苗和幼苗生根狀況，初步確定百子蓮愈傷分化成苗

3、的潮霉素篩選濃度為20mg/L，幼苗生根的潮霉素篩選濃度為15mg/L。
　　 在建立百子蓮遺傳轉(zhuǎn)化體系時，以百子連胚性愈傷組織做為受體組織，運用正交試驗設(shè)計對預(yù)培養(yǎng)時間、菌液濃度、侵菌時間、預(yù)培養(yǎng)基AS的濃度、菌液中AS的濃度5個條件進(jìn)行優(yōu)化，利用每個處理的抗性愈傷率確定每個處理中合適的水平。結(jié)果表明：預(yù)培養(yǎng)5d、菌液濃度(OD600)=0.9、浸菌25min、預(yù)培養(yǎng)乙酰丁香酮(AS)的濃度為50μmol/L、菌液中AS的濃度

4、為100μmol/L時，抗性愈傷率最高。采用GUS組織化學(xué)染色證明了試驗的可行性，報告基因GUS基因在胚性愈傷組織細(xì)胞中能表達(dá)。
　　 應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化百子蓮胚性愈傷組織，然后放到含有抗生素Hyg20mg/L的分化培養(yǎng)基上，進(jìn)行篩選。待分化出胚狀體，放到光下，分化成幼苗，然后將幼苗轉(zhuǎn)接到含有Hyg15mg/L的生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行篩選4-5周。幼苗長出根，移栽出植株到基質(zhì)中生長。
　　 對抗性植株進(jìn)行GUS組織化