高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、紫花苜蓿是世界上栽培最早、分布最廣的優(yōu)質(zhì)豆科牧草之一，其干草產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)成分完全，堪稱(chēng)“牧草之王”，在畜牧業(yè)中占有不容忽視的重要地位。近年來(lái)，我國(guó)越來(lái)越嚴(yán)重的土壤鹽堿化、荒漠化、干旱缺水以及病蟲(chóng)害的頻繁發(fā)生都極大程度地影響了苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)，南方地區(qū)標(biāo)志性的酸性土壤也限制了苜蓿的引種栽培。此外，紫花苜蓿一直面臨著營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)問(wèn)題如干物質(zhì)可消化性低、家畜采食苜蓿后易患膨脹病等。這都要求人們培育出抗逆性強(qiáng)、品質(zhì)好的苜蓿新品種。
　　 傳

2、統(tǒng)育種方法復(fù)雜、周期長(zhǎng)、且育種資源少。近年來(lái)，組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的迅速發(fā)展為人們提供了一種方便快捷的紫花苜蓿新品種培育方法。自從1986年的首例苜蓿轉(zhuǎn)基因成功以來(lái)，苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化的研究已取得一定的進(jìn)展。但現(xiàn)有的紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化效率很低，限制了優(yōu)良外源基因?qū)俎５霓D(zhuǎn)化，從而限制了優(yōu)良苜蓿新品種的獲得。
　　 本研究首次以農(nóng)藝性狀優(yōu)良的紫花苜蓿引進(jìn)栽培種“德寶”為轉(zhuǎn)化受體，將兼具選擇標(biāo)記和目的基因雙重功能的bar基因，采用

3、目前苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化中使用最多、效果最好、轉(zhuǎn)化機(jī)理最清楚的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到受體中，從外植體選擇、bialaphos篩選、共培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌侵染濃度等因素進(jìn)行探索，優(yōu)化苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系，最終建立了高效的苜蓿再生體系和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因體系。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.子葉是德寶苜蓿最好的外植體，其愈傷誘導(dǎo)率最高，可達(dá)97％，最佳bialaphos篩選濃度為2.5mg/L，子葉最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3天，最適農(nóng)桿菌菌液侵染濃度為OD600

4、值0.5-0.7，8-10min是了葉的最佳農(nóng)桿菌侵染時(shí)間，2-3天為子葉的最佳共培養(yǎng)時(shí)間，抗性愈傷率最高可達(dá)30.5％。
　　 2.在含有bialaphos培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選共計(jì)獲得100余株T0代獨(dú)立的轉(zhuǎn)化植株。
　　 3.利用PCR方法對(duì)隨機(jī)選取的50株T0代轉(zhuǎn)基因植株的bar基因進(jìn)行擴(kuò)增，再生植株全部為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。
　　 4.對(duì)PCR陽(yáng)性植株和野生型植株葉片噴施5‰除草劑Basta溶液，陽(yáng)性植株全部