喜樹高效再生體系的建立與農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、喜樹(Camptotheca acuminata)為珙桐科(Nyssaceae)多年生落葉喬木，為我國特有樹種。因其含有重要的抗癌活性物質(zhì)一喜樹堿而備受關(guān)注。本研究以喜樹為研究對象，建立高效的組培再生體系，并在此基礎(chǔ)上，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將細(xì)胞分裂素生物合成限速酶一異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因(枷)導(dǎo)入喜樹體內(nèi)，探索喜樹遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)參數(shù)．初步建立了喜樹遺傳轉(zhuǎn)化體系，為利用基因工程技術(shù)對喜樹進(jìn)行遺傳改良打下基礎(chǔ)。其主要研究內(nèi)容如下： 1．喜

2、樹高效再生體系的建立試驗(yàn)以喜樹種子萌發(fā)生長5-20d的無菌種苗子葉和下胚軸為外植體．以WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)和分化的最佳培養(yǎng)方式為先在WPM+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出不定芽，然后及時轉(zhuǎn)入WPM+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率最高可分別達(dá)到100％和77.8％。不定芽增殖和壯苗培養(yǎng)以WPM+6-BA0.5mg/L培養(yǎng)基最佳，增殖倍數(shù)可達(dá)

3、11.2。最佳生根培養(yǎng)基為WPM+IBA0.5mg/L，生根率達(dá)98％。移栽時，以珍珠巖和田土1：1比例基質(zhì)成活率最高，成活率可達(dá)83％。研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中加入0.1-0.2mg/L2,4-D可加快愈傷組織生長，但不利于愈傷分化，0.1-0.2mg/L的KT在不定芽增殖、壯苗和生根中均具有不利影響。 2．農(nóng)桿菌介導(dǎo)的喜樹遺傳轉(zhuǎn)化體系建立建立了以喜樹子葉和下胚軸為轉(zhuǎn)化受體的根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，初步確定了抗生素卡那霉素(ka

4、n)的篩選濃度，子葉和下胚軸不定芽分化的有效卡那霉素(kan)篩選壓分別為30mg/L和20mg/L，再生苗生根的kan篩選濃度為30mg/L。其次我們還將頭抱霉素(cef)和特美汀(Timentin)兩種抑菌劑對葉片分化不定芽的影響進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)．結(jié)果發(fā)現(xiàn)Timentin對不定芽分化的影響要小于頭孢霉素(Cef)的影響，timentin濃度300mg/L時，子葉分化率達(dá)到42.8％，而cef在同樣的濃度下子葉分化率為17.1％。tim

5、entin的抑菌效果也好于頭孢霉素(Cef)。確定選擇150mg/L的Timentin效果最佳。在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，通過評價(jià)到得的抗性愈傷率，詳細(xì)探討了外植體預(yù)培養(yǎng)時間、浸染菌液濃度、浸染時間、共培養(yǎng)時間等影響因素對轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，選擇喜樹無菌種苗苗齡5-20d的子葉和下胚軸，預(yù)培養(yǎng)2d，菌液濃度在OD值0.5，浸染8-15min，共培養(yǎng)3d為最佳技術(shù)參數(shù)。對獲得的喜樹再生植株進(jìn)行PCR檢測，證實(shí)ipt基因已經(jīng)整合到喜樹基因組中