黃瓜再生體系的建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、黃瓜（Cucumis sativus L.）是我國設(shè)施和露地主要栽培的蔬菜作物之一，生產(chǎn)中黃瓜經(jīng)常受到干旱、鹽堿、病蟲等因素的脅迫，嚴(yán)重影響了黃瓜的品質(zhì)和產(chǎn)量。通過工程手段改良黃瓜現(xiàn)有品種，把育種技術(shù)從宏觀水平提高到微觀水平，為品種改良提供了一條全新途徑。運(yùn)用生物工程技術(shù)培育高產(chǎn)、高抗、多抗、優(yōu)良的黃瓜新品種已經(jīng)成為黃瓜育種工作的發(fā)展方向，為今后持續(xù)培育新品種和大幅度的改良現(xiàn)有品種提供了科學(xué)的手段和途徑。高效的黃瓜再生和轉(zhuǎn)化體系是黃瓜轉(zhuǎn)

2、基因育種的基礎(chǔ)，因此，進(jìn)一步研究影響黃瓜再生和轉(zhuǎn)化的各種因素，優(yōu)化黃瓜再生和轉(zhuǎn)化體系具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　 本課題在前人研究基礎(chǔ)上，從外植體類型、外源植物激素、外植體切割及接種方式、外植體苗齡、內(nèi)源激素變化等方面進(jìn)一步研究影響黃瓜再生的各種因素，建立了完整的黃瓜子葉節(jié)高效再生體系，并在此基礎(chǔ)上通過Kan選擇壓試驗(yàn)建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系，將黃瓜反義 cuPLDα基因轉(zhuǎn)入黃瓜體內(nèi)。取得主要結(jié)果如下：

3、>　　 1．子葉節(jié)是黃瓜離體再生的最佳外植體，子葉節(jié)離體再生受外源植物激素、外植體切割及接種方式、外植體苗齡苗態(tài)等因素的影響。MS 添加1.5 mg/L BA是誘導(dǎo)子葉節(jié)產(chǎn)生不定芽的最佳培養(yǎng)基；切除子葉部分的1/3，切除葉緣平鋪是子葉節(jié)組織培養(yǎng)的最佳切割和接種方式；6-7 d苗齡、兩片子葉張開呈豎直狀態(tài)的無菌苗有較高的再生頻率且便于操作；MS培養(yǎng)基是誘導(dǎo)不定芽生根的最佳培養(yǎng)基；從子葉節(jié)接種開始至再生植株移栽入土為止整個(gè)再生過程約需50

4、 d。
　　 2．子葉節(jié)離體培養(yǎng)培養(yǎng) 0 d時(shí)，ABA 含量最高，IAA和 GA 含量最低；愈傷組織誘導(dǎo)期（3-9 d），ABA、IAA、GA和ZR含量先升高后降低；愈傷組織分化期（9-15 d），IAA和 GA 含量均先升高后降低，ZR 含量一直降低，而ABA含量則先降低后升高。這表明內(nèi)源激素對(duì)黃瓜子葉節(jié)再生過程中的生理狀態(tài)有著極其重要的影響，隨著黃瓜子葉節(jié)再生階段的變化，內(nèi)源激素含量也呈現(xiàn)不同變化，其種類、含量及協(xié)調(diào)平衡是愈

5、傷組織形成和不定芽分化的關(guān)鍵。
　　 3．以子葉節(jié)再生體系為基礎(chǔ)，建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系，主要包括：預(yù)培養(yǎng)、侵染及共培養(yǎng)、選擇及分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等步驟。Kan 選擇壓 150 mg/L可以抑制非轉(zhuǎn)化植株不定芽的產(chǎn)生，濃度為 250 mg/L Cb能夠有效抑制農(nóng)桿菌的生長。對(duì) 250個(gè)子葉節(jié)外植體的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)得到 20個(gè)抗性芽叢，PCR鑒定結(jié)果顯示有 12個(gè)株系呈陽性，轉(zhuǎn)化率為 4.8 ％。RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示