根瘤農桿菌介導的甘草遺傳轉化體系建立.pdf

1、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）是豆科甘草屬灌木狀草本植物，以干燥的根和根莖入藥，是我國傳統(tǒng)大宗常用藥物。野生甘草資源因過度采挖趨于枯竭，人工種植甘草成為緩解供需矛盾的主要途徑。但人工栽培甘草中藥用成分甘草苷含量通常達不到藥典規(guī)定的入藥標準，因此建立甘草高效遺傳轉化體系，研究甘草苷合成相關基因的功能及其作用機制成為甘草品質改良研究的重要內容。
　　本研究針對目前甘草再生體系穩(wěn)定性差，缺乏高效遺傳轉化

2、體系的現(xiàn)狀，以烏拉爾甘草為試驗材料，對培養(yǎng)基成分和外植體類型等影響甘草離體再生的因素進行了探討，建立了甘草高效穩(wěn)定植株再生體系。以根瘤農桿菌EHA105為載體，介導甘草苷合成關鍵基因CHI轉化甘草，建立了高效根瘤農桿菌介導的甘草遺傳轉化體系。主要研究結果如下:
　　1.三種外植體的不定芽分化能力存在很大差異。子葉不能直接分化不定芽;子葉節(jié)不定芽分化率最高為8％，平均每個分化的子葉節(jié)只能形成1-2個不定芽;而子葉節(jié)不定芽分化率高達9

3、0％，平均每個分化的去子葉胚能夠形成3-5個不定芽，不定芽數(shù)≥3的分化率可達80％，所以去子葉胚是進行甘草離體再生及遺傳轉化的最適外植體。
　　2.盡管去子葉胚在MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L培養(yǎng)基上分化率較高，但分化過程中發(fā)生較嚴重玻璃化，降低繼代培養(yǎng)基中6-BA的濃度，無法使已玻璃化個體恢復正常。用6-BA2.0 mg/L水溶液浸泡過夜的種子制備去子葉胚，于MS+6-BA0.5mg/L培養(yǎng)基上誘導分化，

4、不但使去子葉胚的分化率升高，而且使玻璃化率由13％降為7％。
　　3.試管苗轉接種于生根培養(yǎng)基上后，約在第7d產生可見不定根，在MS和1/2MS+IAA0.5mg/L培養(yǎng)基上生根率分別為77％和60％，而在1/2MS培養(yǎng)基上生根率可達93％。
　　4.對甘草PPT敏感性進行了實驗，根據(jù)篩選出轉化子的同時對植物的傷害最低原則，分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中適宜的PPT篩選壓分別為2.0和1.0 mg/L。
　　5.研究了侵染菌

5、濃度、侵染時間、AS濃度、共培養(yǎng)時間等因素對陽性苗率的影響。最適宜甘草遺傳轉化的侵染菌濃度OD600=0.5，侵染時間為30 min;共培養(yǎng)基中AS最適濃度為50 mg/L，最佳共培養(yǎng)時間為4d。在這一轉化條件下，陽性苗率高達10％。
　　6.對抑菌劑Cef的使用濃度進行了選擇，當分化培養(yǎng)基中Cef濃度為300mg/L，去子葉胚的存活率達83％;生根培養(yǎng)基中Cef為200 mg/L時，試管苗污染率為0，生根率為90％。所以分化和生