根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的富有柿遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究.pdf

1、本項(xiàng)研究在已經(jīng)建立的富有柿葉片的高頻再生體系的基礎(chǔ)上，對(duì)影響根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)富有柿葉片遺傳轉(zhuǎn)化的條件進(jìn)行了探索。通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，建立了富有柿葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系；PCR檢測(cè)結(jié)果初步表明，已獲得了ACC合成酶的RNAi的轉(zhuǎn)基因植株。主要研究結(jié)果如下： 1.研究了選擇抗生素壯觀霉素和抑菌劑頭孢霉素對(duì)葉片直接分化不定芽的影響。結(jié)果表明，葉片外植體對(duì)壯觀霉素非常敏感，在分化培養(yǎng)基中附加3

2、0 mg/L的壯觀霉素即可完全抑制不定芽的分化：在生根試驗(yàn)中，確定Sp生根壓力為20 mg/L。頭孢霉素葉片外植體的分化沒(méi)有嚴(yán)重影響，300 mg/L的頭孢霉素就能較好的抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，且不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)到46.3％. 2.建立了以富有柿葉片為轉(zhuǎn)化受體的根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，詳細(xì)探討了預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、侵染菌液濃度、侵染時(shí)間、AS濃度等因素對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)化的影響，并優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件。結(jié)果表明，選擇預(yù)培養(yǎng)3 d的葉片，用

3、OD<,600>為0.4的菌液侵染7 min后，轉(zhuǎn)到1/2MS+ZT 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L+AS 150 umol/L的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)4 d，再通過(guò)延遲篩選4 d，可獲得較好的轉(zhuǎn)化效果，抗性芽率最高的可達(dá)13.64.％。 3.通過(guò)建立的遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得246株抗性苗，其中4株經(jīng)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性。 4.研究了暗培養(yǎng)時(shí)間、蔗糖濃度、光照強(qiáng)度、閉瓶鍛煉時(shí)間對(duì)培育富有柿健壯生根苗的效果。結(jié)果表明，在蔗糖濃

4、度為20 g/L的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的試管苗，暗培養(yǎng)8 d，在30 000 1x的光照下，閉瓶鍛煉21 d，對(duì)富有柿培育健壯生根苗有很大的促進(jìn)作用。此條件下，培育的生根苗較好：生根率高，根系發(fā)達(dá)，試管苗生長(zhǎng)健壯，芽點(diǎn)飽滿。 5.初步探討了溫度、濕度和移栽基質(zhì)對(duì)移栽成活率的影響，生根試管苗移栽到以蛭石：珍珠巖=1:1的基質(zhì)中，進(jìn)行過(guò)渡移栽。保持小拱棚溫度在25～30℃。移栽前10 d，保持棚內(nèi)濕度在90％～100％，能獲得較好的移栽成活