苧麻遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)建立及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、苧麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)是我國重要的韌皮纖維作物之一,栽培和加工歷史悠久。我國加入WTO后,隨著市場需求和麻紡工業(yè)的發(fā)展,對原麻的品質(zhì)要求越來越高,生產(chǎn)上對優(yōu)良品種的需求也越柬越迫切。然而苧麻遺傳背景復(fù)雜,現(xiàn)有的育種手段比較單一,育種周期較長?；蚬こ虅t能在較短時間里,將某些高產(chǎn)、抗逆或其他優(yōu)良性狀基因?qū)氍F(xiàn)有品種中,與傳統(tǒng)育種手段相結(jié)合,將大大縮短育種進(jìn)程。但是目前苧麻基因工程研究尚處在起步階段,缺少能夠

2、應(yīng)用的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。
　　 本研究從建立穩(wěn)定高效的再生體系著手,建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苧麻子葉高效遺傳轉(zhuǎn)化體系,導(dǎo)入了GFP、PSAG12-ipt、Bt等報告或目的基因,并對苧麻直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生和苧麻體細(xì)胞無性系變異進(jìn)行了初步研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.研究了供體苗齡、基本培養(yǎng)基類型、TDZ濃度、光照條件以及基因型等因素對不同外植體再生的影響,建立了苧麻不同外植體的穩(wěn)定高效再生體系。研究表明。以上因素都能顯

3、著影響苧麻不同外植體再生。對于種子實生苗外植體而言,子葉和葉片都能直接再生出不定芽,苗齡4d的子葉為最佳外植體類型:品系“5041-3”的子葉最高再生頻率達(dá)到了86.2％,再生芽個數(shù)為4.4個；最合適的基本培養(yǎng)基為MS無機(jī)鹽+B5有機(jī)成分(MSB),TDZ濃度以0.5mg/L為最佳,與之搭配使用的適宜生長素為0.01mg/L IAA或者NAA,培養(yǎng)時16h光照/8h黑暗的光周期有利于不定芽的分化。對于試管苗外植體而言,應(yīng)用以上再生體系也

4、能獲得高頻率的再生,但以苗齡為60d的小植株上部的外植體為宜。從以上實驗所得到的再生芽在附加1.0mg/L BA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行伸長生長,然后在附加0.025mg/L NAA的1/2MS培養(yǎng)基中生根,煉苗15d后即可移栽到大田。
　　 2.研究了高濃度TDZ在苧麻子葉直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的作用,初步建立了苧麻子葉直接體細(xì)胞胍胎發(fā)生的有效方法。結(jié)果表明,1.0-2.0mg/L TDZ和低濃度的IAA配合使用都能誘導(dǎo)苧麻子葉直接體

5、細(xì)胞胚胎發(fā)生,最適合的培養(yǎng)基為附加2.0mg/L TDZ和0.005mg/L IAA的MS培養(yǎng)基,部分胚在附加0.5mg/L TDZ和0.01mg/L IAA的MS培養(yǎng)基上能發(fā)育成植株。
　　 3.利用流式細(xì)胞儀、RAPD技術(shù)對試管苗各外植體再生植株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明,再生植株的DNA倍性沒有發(fā)生改變:利用從100條引物中篩選出的43條RAPD引物對再生植株進(jìn)行檢測,直接從葉片產(chǎn)生的再生植株和從葉柄或

6、莖段上經(jīng)過了愈傷組織階段產(chǎn)生的再生植株中都沒有檢測到RAPD擴(kuò)增多態(tài)性,說明本研究建立的再生體系具有較好的遺傳穩(wěn)定性,不容易發(fā)生體細(xì)胞無件系變異。
　　 4.研究了外植體類型、農(nóng)桿菌菌液濃度、子葉預(yù)培養(yǎng)、乙酰丁香酮(AS)、共培養(yǎng)的光照條件、共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時間、共培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值對轉(zhuǎn)化效率的影響,建立了高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)苧麻遺傳轉(zhuǎn)化體系。實驗結(jié)果表明:不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的子葉是最有效的受體類型,利用0.25-0.8OD的農(nóng)桿菌菌液

7、,在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入50-100mg/L AS,在溫度20℃、培養(yǎng)基pH5.8-5.9的黑暗條件下共培養(yǎng)48-72h能夠獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。經(jīng)過驗證,用以上參數(shù)建立的轉(zhuǎn)化體系對于其他基因型依然有效,最高的抗性芽再生頻率達(dá)到了25％左右。對抗性植株分別進(jìn)行GUS、卡那霉素涂抹、PCR和Southern雜交檢測,證實外源基因已經(jīng)整合到苧麻基因組中,并能有效表達(dá)。
　　 5.利用建立的遺傳轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化不同基因型苧麻,分別得到了轉(zhuǎn)GF