月季品種‘薩蔓莎’植株再生體系的建立和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、月季是園林中應(yīng)用最廣的木本花卉之一，因其花朵美麗、四季開花、適應(yīng)性廣、耐修剪能力強(qiáng)，在我國(guó)廣泛栽培。切花月季是世界四大切花之一，然而，月季切花的瓶插壽命相比于菊花、香石竹要短得多。近些年來(lái)，不少研究者圍繞著月季切花衰老和保鮮問題進(jìn)行了廣泛的探討，但最終未能從根本上解決問題。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明在某些切花月季品種的開花和衰老過(guò)程中，乙烯合成呈現(xiàn)躍變型特征，外源乙烯處理加速花朵的衰老，而乙烯合成或作用抑制劑處理有利于延長(zhǎng)花期，這些表現(xiàn)與乙

2、烯躍變型切花非常相似。 本研究的主要目標(biāo)是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入ACC氧化酶反義基因，利用反義RNA技術(shù)，抑制月季切花的乙烯合成，從而獲得花期延長(zhǎng)的月季植株。圍繞這一目標(biāo)，本研究以類似乙烯躍變型月季品種‘薩蔓莎’為試材，首先建立了該品種的離體微繁及植株再生體系，并就基因型、外植體類型、培養(yǎng)條件和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等因素對(duì)月季葉片直接再生體系和間接再生體系的影響進(jìn)行了詳細(xì)的研究；然后利用GUS報(bào)告基因?qū)τ绊懜┺r(nóng)桿菌介導(dǎo)月季

3、遺傳轉(zhuǎn)化的條件作了深入探索，通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，建立了月季愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系；最后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行ACC氧化酶反義基因的轉(zhuǎn)化，并由PCR檢測(cè)結(jié)果證明獲得了月季‘薩蔓莎’轉(zhuǎn)化的愈傷組織。本研究主要的研究結(jié)果如下： 1.建立了月季4個(gè)品種的離體微繁體系。以武漢地區(qū)市場(chǎng)效益較好的月季品種，包括紅色系的‘薩蔓莎’、‘紅衣主教’和黃色系的‘金獎(jiǎng)?wù)隆?、‘黃和平’為材料，建立其離體微繁體系。研究結(jié)果表明：初代接種材料的采集宜在春季的4～5月間進(jìn)

4、行，此時(shí)當(dāng)年生枝條開始木質(zhì)化，不容易失水，且經(jīng)歷了冬季低溫，病蟲害少，易于滅菌消毒；4個(gè)品種初代培養(yǎng)枝條上的腋芽在MS+0.5mg/LBA+0.004mg/LNAA+0.1mg/LGA3培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3周后，可陸續(xù)萌發(fā)，萌芽率達(dá)70％左右；將幼芽切下后每4周一次繼代在新鮮的擴(kuò)繁培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的適應(yīng)過(guò)程，各品種試管苗的增殖效果都表現(xiàn)良好，其中，品種‘金獎(jiǎng)?wù)隆汀S和平’相比于‘薩蔓莎’和‘紅衣主教’需要經(jīng)歷更長(zhǎng)的適應(yīng)期；繼代培養(yǎng)

5、約4周后的枝條轉(zhuǎn)入1/2MS+0.1mg/LIBA生根培養(yǎng)基中，20～30d后產(chǎn)生不定根；移栽成活的關(guān)鍵是生根試管苗的成熟程度，開始木質(zhì)化的粗壯的試管苗移栽成活率高，約為80％，但幼嫩的試管苗因容易失水，抵抗力較差，而成活率低。2.建立了月季品種‘薩蔓莎’直接器官發(fā)生途徑的植株再生體系。分別以月季品種‘薩蔓莎’、‘紅衣主教’、‘金獎(jiǎng)?wù)隆汀S和平’的小葉或復(fù)葉柄為外植體，研究了不同基因型、外植體、葉位、暗培養(yǎng)時(shí)間和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽

6、分化和植株再生的影響。結(jié)果表明：基因型對(duì)植株再生有重要影響，4個(gè)品種中僅‘薩蔓莎’能產(chǎn)生正常不定芽并完成植株再生，另外3個(gè)品種的小葉柄基部雖能產(chǎn)生突起，但無(wú)法再生植株；‘薩蔓莎’在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+1.5mg/LTDZ+0.05mg/LNAA+10mg/LAgNO3)上黑暗培養(yǎng)8d后轉(zhuǎn)入發(fā)枝培養(yǎng)基(MS+0.5mg/LBA+0.01mg/LNAA+0.1mg/LGA3)中光下培養(yǎng)，再生效果最好；暗培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，易形成愈傷組織而不利于不定

7、芽的分化和植株再生；小葉外植體和復(fù)葉柄的再生率分別為51.8％和10％，而小葉的葉位對(duì)植株再生無(wú)顯著影響；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中NAA的效果優(yōu)于IBA，生長(zhǎng)素濃度升高易導(dǎo)致愈傷組織形成而影響植株再生。 3.建立了月季品種‘薩蔓莎’間接器官發(fā)生途徑的植株再生體系。以月季品種‘薩蔓莎’試管苗小葉為外植體，探討了愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的方法。結(jié)果表明：月季‘薩蔓莎’間接器官發(fā)生途徑的植株再生需要經(jīng)歷外植體愈傷組織誘導(dǎo)、假珠芽的發(fā)生、可增殖愈

8、傷組織的選擇和愈傷組織的分化4個(gè)階段；高濃度的生長(zhǎng)素有利于誘導(dǎo)小葉外植體產(chǎn)生愈傷組織，在NAA、2,4-D和pCPA這3種生長(zhǎng)素中，以2,4-D的誘導(dǎo)效果最好；經(jīng)7.0～10.0mg/L2,4-D光下誘導(dǎo)愈傷15d的小葉外植體在含1.5mg/LTDZ的MS培養(yǎng)基上光下培養(yǎng)約20d后有白色假珠芽形成；將此假珠芽分離后黑暗培養(yǎng)在含0.25mg/LNAA、1.5mg/LZT和1.0mg/LGA3的培養(yǎng)基上，在繼代的過(guò)程中產(chǎn)生新的假珠芽和新的愈

9、傷組織，通過(guò)持續(xù)選擇生活力高、生命力強(qiáng)的組織，約一年后獲得可長(zhǎng)期繼代增殖的愈傷組織，此愈傷組織白色至淡黃色，疏松顆粒狀，活力旺盛，到目前為止已保存了16個(gè)月；愈傷組織在1.0mg/LTDZ、0.01mg/LNAA和0.1mg/LGA3的誘導(dǎo)下30d內(nèi)分化出不定芽，在含2.0mg/LBA和0.05mg/LNAA的MS培養(yǎng)基上不定芽伸長(zhǎng)形成正常植株。 4.建立了以愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體的根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系。根據(jù)本研究建立的月季‘薩蔓

10、莎’的兩種再生體系，以小葉和愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行GUS報(bào)告基因的遺傳轉(zhuǎn)化。首先測(cè)試了選擇抗生素潮霉素對(duì)小葉直接分化不定芽和愈傷組織增殖的影響，結(jié)果表明，小葉外植體對(duì)潮霉素非常敏感，發(fā)枝培養(yǎng)基中6mg/L潮霉素可完全抑制不定芽的生長(zhǎng)，而愈傷組織由于分裂能力強(qiáng)，對(duì)潮霉素的忍耐性也要高得多，潮霉素濃度為70mg/L時(shí)可抑制90％的愈傷組織生長(zhǎng)。以小葉和愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體材料，通過(guò)評(píng)價(jià)GUS基因瞬間表達(dá)結(jié)果，詳細(xì)地探討了外植體、共培養(yǎng)時(shí)光照條

11、件、共培養(yǎng)培養(yǎng)基中鹽濃度、AS濃度、pH值、菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間和共培養(yǎng)溫度對(duì)T-DNA轉(zhuǎn)化的影響，并優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件。結(jié)果表明：外植體類型是影響月季‘薩蔓莎’遺傳轉(zhuǎn)化成敗的關(guān)鍵，小葉外植體對(duì)農(nóng)桿菌的浸染反應(yīng)不敏感，在不同的轉(zhuǎn)化條件下，均未觀測(cè)到GUS基因瞬間表達(dá)，而愈傷組織GUS基因瞬間表達(dá)量高，表現(xiàn)出很強(qiáng)的接受外源DNA的能力，但這種能力在不同的轉(zhuǎn)化條件下也存在顯著的差異；除外植體類型外，光照條件、共培養(yǎng)培養(yǎng)基中AS濃度和鹽

12、濃度也是影響T-DNA轉(zhuǎn)化的重要因子，而侵染時(shí)間和共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH值對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響不大；菌液濃度、共培養(yǎng)時(shí)間和共培養(yǎng)溫度的水平在一定范圍內(nèi)與GUS基因的瞬間表達(dá)量呈正比，此3因素的水平過(guò)高和過(guò)低都不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化；將愈傷組織與OD600=0.5～0.8的菌液侵染20min，然后在黑暗、23℃條件下于含30μMAS的鹽類減半的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d可獲得最佳的T-DNA轉(zhuǎn)化效率。利用此優(yōu)化的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行農(nóng)桿菌的侵染，并在含70mg/L潮

13、霉素和300mg/L頭孢霉素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇，3個(gè)月后經(jīng)PCR檢測(cè)證明獲得含GUS基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的愈傷組織。 5.獲得了ACC氧化酶反義基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的愈傷組織。按照優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，利用含潮霉素選擇基因和ACO反義基因的EHA105菌株和GV3101菌株對(duì)月季‘薩蔓莎’愈傷組織進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，結(jié)果表明：共培養(yǎng)期間GV3101菌株比EHA105菌株生長(zhǎng)慢，因此共培養(yǎng)時(shí)間為5d；PCR結(jié)果證明獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的愈傷組織。