紫花苜蓿高頻再生體系的建立及農桿菌介導的木霉幾丁質酶基因轉化的研究.pdf

1、本文利用農桿菌介導法，將木霉幾丁質酶基因轉入紫花苜蓿秘魯中，提高其抗菌性。 本文探討了三種品種紫花苜蓿(隴東苜蓿、阿爾岡金、秘魯)的組織培養(yǎng)程序，確定出再生能力最強的品種及外植體。通過植物表達載體(PBI121+CHI)的構建，利用農桿菌介導法轉化木霉幾丁質酶(CHI)基因，建立了一套農桿菌介導苜?；蜣D化的優(yōu)化體系。 主要研究結果如下：1、組織培養(yǎng)再生能力的建立試驗表明：MS+2,4-D(2.0mg/L)+6-BA(0

2、.5mg/L)+蔗糖0.3﹪+瓊脂0.08﹪；MS+KT(0.5mg/L)+NAA(0.01mg/L)+蔗糖0.3﹪+瓊脂0.08﹪；1/2MS+NAA(0.01mg/L+蔗糖0.15﹪+瓊脂0.08﹪分別是紫花苜蓿的愈傷組織、芽、根的適宜誘導培養(yǎng)基。下胚軸的愈傷組織誘導率相對高于子葉節(jié)，并且不同品種間秘魯遠遠高于阿爾岡金和隴東苜蓿，通過三個不同品種的六組重復試驗數據表明，在A3培養(yǎng)基上下胚軸愈傷組織誘導率比子葉節(jié)的高，但分化效果卻相對

3、低。由此可見，不同激素濃度配比的培養(yǎng)基再生體系的建立影響不同。在4種分化培養(yǎng)基中B1培養(yǎng)基植株再生分化頻率最高可達96﹪，B4分化頻率最低，下胚軸：B4＜B1＜B2＜B3(52﹪＜58﹪＜64﹪＜74﹪)；子葉節(jié)：B4＜B3＜B2＜B1(56﹪＜60﹪＜82﹪＜96﹪)。在相同生長素濃度、不同細胞分裂素濃度的分化培養(yǎng)基中，B1培養(yǎng)基分化頻率相對高于其它培養(yǎng)基，即：B1＞B2＞B3＞B4。試驗結果表明，愈傷組織分化頻率不是由激素配比值決定

4、的，而是由不同濃度激素之間協(xié)同作用的結果。本試驗中B1為最佳分化培養(yǎng)基，紫花苜蓿秘魯子葉節(jié)分化頻率最高。 2、植物表達載體的構建將目的基因(CHI，序列長度1275bp左右)克隆到植物雙元表達載體PBI121(14758bp)上，即：CHI基因取代GUS基因插入到質粒PBI121上，構建成表達載體PBI121+CHI，通過凍融法轉化到根癌農桿菌中，得到植物表達載體。 3、CHI基因轉化體系的建立以農桿菌為載體，對紫花苜蓿