CpTI和ChiA基因的克隆，雙價(jià)表達(dá)載體構(gòu)建及其農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、畜牧業(yè)是我國重要的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)，紫花苜蓿是畜牧業(yè)中重要的飼草，素稱“牧草之王”。但近幾年來病蟲害問題越來越嚴(yán)重，已經(jīng)成為制約紫花苜蓿生產(chǎn)的一個(gè)重要的因素。在我國北方地區(qū)，尤其以真菌性病害如褐斑病、霜霉病和銹病發(fā)生嚴(yán)重；蟲害種類也比較多，其中主要是粘蟲和蚜蟲等。近年來作物育種學(xué)家們一直致力于提高苜?？共∠x害能力的研究，隨著基因工程的興起，為我們?cè)诃h(huán)境友好的基礎(chǔ)上防治病蟲害提供了一種新的手段和方法。許多實(shí)驗(yàn)都已經(jīng)證明：幾丁質(zhì)酶(Chitinas

2、)主要具有降解真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)的作用，從而達(dá)到抑制真菌增長的功能，同時(shí)兼具殺蟲功能；豇豆胰蛋白酶抑制劑(Cowpea trypsin inhibitor,CpTI)直接作用于昆蟲消化系統(tǒng)造成昆蟲非正常死亡，具廣譜殺蟲功能。本研究分別從苜蓿和豇豆克隆了這兩個(gè)基因，構(gòu)建成雙價(jià)植物表達(dá)載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將之轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，初步得到抗性愈傷。其結(jié)果如下： 1.提取豇豆葉片DNA，設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過PCR特異擴(kuò)增得到324 bp大小的

3、片斷，克隆到pMD-18T載體上，并轉(zhuǎn)化E．coli DH5α，得到重組子pMD-CpTI，酶切并測(cè)序鑒定，該片段分子大小為324 bp，將該基因登陸到GeneBank(NO．EU088405)并進(jìn)行同源性鑒定，證明該基因?yàn)榻z氨酸蛋白酶抑制劑基因家族中的一員。在此基礎(chǔ)上，將CpTI基因用限制性內(nèi)切酶BamH I/Sac I切下后，克隆到pCUbil303 的UBI啟動(dòng)子和NOS終止子之間。經(jīng)PCR和酶切鑒定，得到了該基因的真核表達(dá)載體p

4、ClJbi1303CpTI，為下一步的轉(zhuǎn)基因做好了準(zhǔn)備。 2.將CpTI刀基因克隆到E．coli表達(dá)載體pGEX4T-1上，經(jīng)酶切鑒定后，得到重組質(zhì)粒pGEX4T-CpTI，在濃度0.08 mmol/L的IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)出37 KD的蛋白，證明該基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中可以正常表達(dá)。 3.用水楊酸結(jié)合機(jī)械刺傷法誘導(dǎo)培育15 d左右的紫花苜蓿植株，根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性引物，分別從苜蓿的基因組DNA及總RNA克隆得到大小為984

5、 bp的片斷。將之克隆到pMD-18T載體上，得到重組子pMD-ChiA，酶切并測(cè)序鑒定，該基因的DNA與cDNA的核酸序列完全一致。將該基因登陸到GeneBank(NO．EU294179)并進(jìn)行同源性鑒定，核苷酸順序與蘭州報(bào)道的紫花苜蓿上的同源性可達(dá)到100％，并具有典型的N端信號(hào)肽序列、幾丁質(zhì)結(jié)合域、可變間隔區(qū)和催化區(qū)，證明是Ⅰ類幾丁質(zhì)酶基因。 4.將pMD-ChiA和pMD-CpTI分別Noc I和Pml Ⅰ雙酶切，先后插

6、入到植物表達(dá)載體pC35S1303上，經(jīng)限制性酶切及PCR分子驗(yàn)證，表明構(gòu)建的雙價(jià)植物表達(dá)載體pC35S1303-ChiA-CpTI正確。隨后，將雙價(jià)植物表達(dá)載體pC35S1303-ChiA-CpTI轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404受體菌中，得到了用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的工程菌株LBA4404。 5.用9％的NaClO處理紫花苜蓿種子，培育苜蓿無菌苗，以苜蓿的葉片和下胚軸為外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，黑暗培養(yǎng)3 d后，轉(zhuǎn)入到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基。