CMO和BADH雙價(jià)基因的無選擇標(biāo)記表達(dá)載體轉(zhuǎn)化苜蓿的研究.pdf

1、土壤鹽堿化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重問題，苜蓿既是改良土壤、保持水土的重要植物，同時(shí)又是重要的飼料作物。苜蓿轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)行的較早、廣泛也較成功。采用傳統(tǒng)的育種方法，選育耐鹽品種進(jìn)展極為緩慢。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，本課題研究是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將抗旱耐鹽基因轉(zhuǎn)入苜蓿中，從而可以提高苜蓿的耐鹽堿性。 本研究主要以苜蓿的無菌子葉作為外植體，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生。通過對培養(yǎng)基成分等一些影響因素的優(yōu)化，完成苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織的分化

2、、出苗以及生根的整個(gè)再生過程。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對其進(jìn)行抗旱耐鹽基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究，以期獲得轉(zhuǎn)基因植株并對其進(jìn)行有關(guān)耐鹽堿性生理指標(biāo)的檢測，取得的主要結(jié)果如下： 1、本實(shí)驗(yàn)分別優(yōu)化了苜蓿子葉節(jié)各個(gè)時(shí)期的培養(yǎng)基成分：(MS+2，4-D2.0mg/L+KT0.25 mg/L，蔗糖3％，pH5.8)培養(yǎng)基可誘導(dǎo)苜?？烧T導(dǎo)苜蓿愈傷組織；在(MS+NAA0.05mg/L+6BA0.5 mg/L，蔗糖3％，pH5.8)和MS、1/2MS(

3、蔗糖1.5％，pH5.8)培養(yǎng)基上正常發(fā)育、萌發(fā)成苗以及生根。 2、本實(shí)驗(yàn)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將BADH和CMO雙價(jià)耐鹽基因?qū)胲俎Ｖ?，探討了不同的侵染時(shí)間、不同的菌液的濃度等條件對轉(zhuǎn)化效果的影響。結(jié)果表明，濃度(OD值)在0.3-0.5左右，侵染25分鐘時(shí)的愈傷組織的侵染效果最好，轉(zhuǎn)化率較高，并采用40mmol/L的含鹽培養(yǎng)基對其進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)化過程中得到了抗性植株。 3、對得到的抗性植株提取其葉片DNA進(jìn)行PCR檢測以及P

4、CR-southern鑒定，結(jié)果表明，PCR檢測為陽性的兩個(gè)單株均有與陽性對照大小完全一致的雜交帶出現(xiàn)，與PCR檢測結(jié)果完全吻合，而非轉(zhuǎn)基因植株沒有雜交信號出現(xiàn)，說明PCR產(chǎn)物確實(shí)是BADH基因，而不是苜?；蚪M中的同源序列，從而證明外源基因BADH和CMO已成功的整合到基因組中。 4、本實(shí)驗(yàn)對轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行了耐鹽性生理指標(biāo)檢測，分別為甜菜堿含量的對比測定、細(xì)胞膜透性、游離脯氨酸含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性以及過氧化

5、物酶活性。結(jié)果表明：甜菜堿、膜透性脯氨酸含量和丙二醛含量隨著鹽脅迫的增強(qiáng)在增加，且都高于無鹽脅迫下的值，而SOD，POD活性則正相反，隨著鹽脅迫的減弱其活性逐漸減小，并且隨著脅迫天數(shù)的增加逐漸下降。對轉(zhuǎn)化苗在濃度為1.0％的堿性鹽水澆灌條件下，定期測其生理指標(biāo)，并與非轉(zhuǎn)化苗的指標(biāo)作對比，發(fā)現(xiàn)其甜菜堿的含量有所增加，但是其細(xì)胞膜透性、丙二醛含量有著明顯的降低，而超氧化物歧化酶活性以及過氧化物酶活性有明顯的提高，但對于脯氨酸二者則沒有顯著的