BADH基因轉(zhuǎn)化羊草(Leymus chinensis)的研究.pdf

1、土壤鹽堿化是人類面臨的生態(tài)危機(jī)之一，是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重問題。全世界有3．8×109h㎡土地具有不同程度的鹽漬化，我國約有鹽堿化土壤3．4×108h㎡，并且在逐年遞增。人們采取了多種治理鹽堿地的措施，培育耐鹽堿植物是當(dāng)前治理和改良鹽堿化土地的一條行之有效的途徑。 羊草（chinese wildrye）是分布于我國東北及內(nèi)蒙古地區(qū)天然草地面積較廣且較耐鹽堿的最優(yōu)良牧草，具有一定抗鹽堿和改良鹽堿地的能力，是建立人工草地和治

2、理鹽堿化草地的理想草種。但是由于近年來的過度開發(fā)和利用，造成天然羊草草原的退化。為了保護(hù)羊草資源和為了更好地發(fā)揮羊草改良鹽堿地的作用，就要根據(jù)羊草生育規(guī)律及生物學(xué)特性，不斷開展羊草耐鹽堿新品種的選育研究。 采用傳統(tǒng)的育種方法選育耐鹽品種極為緩慢，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們可以用基因工程技術(shù)提高植物的耐鹽堿性。提高植物抗鹽性最根本、最經(jīng)濟(jì)、最有效的方法是充分利用抗鹽基因，培育轉(zhuǎn)基因植物新品種。轉(zhuǎn)基因的方法有很多，基因槍法轉(zhuǎn)化因

3、其不受受體植物范圍的限制，是目前轉(zhuǎn)基因研究中應(yīng)用較為廣泛的一種方法?，F(xiàn)常用的耐鹽堿基因有很多，甜菜堿合成酶基因是最重要的和最有希望的脅迫抗性基因。甜菜堿合成途徑簡單，進(jìn)行遺傳操作方便。 在高等植物中，甜萊堿由膽堿經(jīng)兩步酶催化得到，即：膽堿→甜菜堿醛→甜菜堿，分別由膽堿單加氧酶（CMO）和甜菜堿醛脫氫酶（BADH）催化。目前已克隆到這兩個(gè)酶的基因，并已在轉(zhuǎn)基因植物中得到表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植物的抗鹽性有所提高。 轉(zhuǎn)基因植物的安全性

4、問題引起了科學(xué)界長時(shí)間的爭議，其潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)備受關(guān)注。一方面，要選擇植物來源的外源基因，最好是來源于可食用植物；另一方面，要去除抗生素等選擇標(biāo)記。構(gòu)建無抗生素選擇標(biāo)記的植物表達(dá)載體，獲得的轉(zhuǎn)基因植物可以直接用于常規(guī)育種，省去了大量生物安全性檢測步驟，加快了育種進(jìn)程，更加有利于加快轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品推廣的速度。 本研究利用利用基因槍法將無抗生素選擇標(biāo)記的甜菜堿醛脫氫酶基因轉(zhuǎn)入吉生1號(hào)羊草愈傷組織，開展羊草組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化研究，通過組織培

5、養(yǎng)獲得了轉(zhuǎn)基因耐鹽堿再生植株，并對(duì)轉(zhuǎn)基因羊草進(jìn)行了相關(guān)檢測。 取得的主要研究結(jié)果如下： 1、綜合增重指數(shù)和愈傷組織生長狀態(tài)兩種因素考慮，確定了羊草愈傷組織對(duì)堿性鹽的可耐最大強(qiáng)度為4mmoL/L，用此臨界濃度對(duì)基因槍轉(zhuǎn)化后的愈傷組織進(jìn)行篩選。 2、基因槍轉(zhuǎn)化后，獲得再生植株62株，經(jīng)35s啟動(dòng)子引物PCR檢測和Southern雜交，呈陽性的為8株，轉(zhuǎn)化頻率為12．90％。 3、羊草植株對(duì)堿性鹽的可耐最大強(qiáng)度

6、為150mmoL/L，轉(zhuǎn)基因羊草植株對(duì)堿性鹽的可耐最大強(qiáng)度為200mmoL/L，說明轉(zhuǎn)基因羊草的耐鹽堿能力強(qiáng)于對(duì)照。 4、脅迫7天后，轉(zhuǎn)基因羊草的甜萊堿含量增加，說明轉(zhuǎn)基因羊草較對(duì)照羊草更具抗旱性。 5、通過對(duì)轉(zhuǎn)抗鹽基因的植株在不同濃度的堿性鹽脅迫下各指標(biāo)的檢測發(fā)現(xiàn)，其丙二醛含量較未轉(zhuǎn)化苗低；脯氨酸含量、SOD和POD活性則有顯著的升高。轉(zhuǎn)基因植株在200mmol/L的濃度下可以健壯的生長，說明轉(zhuǎn)BADH基因后的羊草在耐