BADH基因轉(zhuǎn)化羊草(Leymus chinensis)的研究.pdf

1、土壤鹽堿化是人類面臨的生態(tài)危機之一，是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的嚴重問題。全世界有3．8×109h㎡土地具有不同程度的鹽漬化，我國約有鹽堿化土壤3．4×108h㎡，并且在逐年遞增。人們采取了多種治理鹽堿地的措施，培育耐鹽堿植物是當前治理和改良鹽堿化土地的一條行之有效的途徑。 羊草（chinese wildrye）是分布于我國東北及內(nèi)蒙古地區(qū)天然草地面積較廣且較耐鹽堿的最優(yōu)良牧草，具有一定抗鹽堿和改良鹽堿地的能力，是建立人工草地和治

2、理鹽堿化草地的理想草種。但是由于近年來的過度開發(fā)和利用，造成天然羊草草原的退化。為了保護羊草資源和為了更好地發(fā)揮羊草改良鹽堿地的作用，就要根據(jù)羊草生育規(guī)律及生物學特性，不斷開展羊草耐鹽堿新品種的選育研究。 采用傳統(tǒng)的育種方法選育耐鹽品種極為緩慢，隨著分子生物學技術的發(fā)展，人們可以用基因工程技術提高植物的耐鹽堿性。提高植物抗鹽性最根本、最經(jīng)濟、最有效的方法是充分利用抗鹽基因，培育轉(zhuǎn)基因植物新品種。轉(zhuǎn)基因的方法有很多，基因槍法轉(zhuǎn)化因

3、其不受受體植物范圍的限制，是目前轉(zhuǎn)基因研究中應用較為廣泛的一種方法?，F(xiàn)常用的耐鹽堿基因有很多，甜菜堿合成酶基因是最重要的和最有希望的脅迫抗性基因。甜菜堿合成途徑簡單，進行遺傳操作方便。 在高等植物中，甜萊堿由膽堿經(jīng)兩步酶催化得到，即：膽堿→甜菜堿醛→甜菜堿，分別由膽堿單加氧酶（CMO）和甜菜堿醛脫氫酶（BADH）催化。目前已克隆到這兩個酶的基因，并已在轉(zhuǎn)基因植物中得到表達，轉(zhuǎn)基因植物的抗鹽性有所提高。 轉(zhuǎn)基因植物的安全性

4、問題引起了科學界長時間的爭議，其潛在生態(tài)風險備受關注。一方面，要選擇植物來源的外源基因，最好是來源于可食用植物；另一方面，要去除抗生素等選擇標記。構(gòu)建無抗生素選擇標記的植物表達載體，獲得的轉(zhuǎn)基因植物可以直接用于常規(guī)育種，省去了大量生物安全性檢測步驟，加快了育種進程，更加有利于加快轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品推廣的速度。 本研究利用利用基因槍法將無抗生素選擇標記的甜菜堿醛脫氫酶基因轉(zhuǎn)入吉生1號羊草愈傷組織，開展羊草組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化研究，通過組織培

5、養(yǎng)獲得了轉(zhuǎn)基因耐鹽堿再生植株，并對轉(zhuǎn)基因羊草進行了相關檢測。 取得的主要研究結(jié)果如下： 1、綜合增重指數(shù)和愈傷組織生長狀態(tài)兩種因素考慮，確定了羊草愈傷組織對堿性鹽的可耐最大強度為4mmoL/L，用此臨界濃度對基因槍轉(zhuǎn)化后的愈傷組織進行篩選。 2、基因槍轉(zhuǎn)化后，獲得再生植株62株，經(jīng)35s啟動子引物PCR檢測和Southern雜交，呈陽性的為8株，轉(zhuǎn)化頻率為12．90％。 3、羊草植株對堿性鹽的可耐最大強度

6、為150mmoL/L，轉(zhuǎn)基因羊草植株對堿性鹽的可耐最大強度為200mmoL/L，說明轉(zhuǎn)基因羊草的耐鹽堿能力強于對照。 4、脅迫7天后，轉(zhuǎn)基因羊草的甜萊堿含量增加，說明轉(zhuǎn)基因羊草較對照羊草更具抗旱性。 5、通過對轉(zhuǎn)抗鹽基因的植株在不同濃度的堿性鹽脅迫下各指標的檢測發(fā)現(xiàn)，其丙二醛含量較未轉(zhuǎn)化苗低；脯氨酸含量、SOD和POD活性則有顯著的升高。轉(zhuǎn)基因植株在200mmol/L的濃度下可以健壯的生長，說明轉(zhuǎn)BADH基因后的羊草在耐