BADH和CMO基因的無選擇標記表達載體轉化玉米的研究.pdf

1、玉米是重要的糧食和飼料作物，也是現(xiàn)代食品、醫(yī)藥、化學工業(yè)的重要原料作物，玉米是對鹽分中度敏感的作物，土壤干旱、鹽堿脅迫是降低其產(chǎn)量的主要環(huán)境因素之一，因此，培育耐鹽玉米品種具有重要的意義。采用傳統(tǒng)的育種方法選育抗旱耐鹽品種極為緩慢。隨著分子生物學技術的發(fā)展，利用基因工程技術培育抗逆植物新品種已成為21世紀農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個重要方向。目前，多數(shù)植物的遺傳轉化都要使用選擇標記基因，諸如抗生素或除草劑抗性基因等來篩選轉化子，雖然仍無直接研究結果表

2、明選擇標記基因影響人類健康或環(huán)境安全，但引起了人們對轉基因產(chǎn)品安全性的擔心。為了消除轉基因作物的安全性顧慮，無選擇標記轉基因植物應運而生。本實驗采用無選擇標記的BADH和CMO基因表達載體轉化玉米，為培育出具有安全、高度耐鹽堿的玉米新品種打下良好基礎。 本文采用玉米常用自交系為受體材料，對膽堿單加氧酶基因(CMO)和甜菜堿醛脫氫酶基因(BADH)的無選擇標記表達載體轉化玉米進行了研究，鑒定了玉米愈傷組織及苗耐鹽堿性敏感性，確定玉

3、米愈傷組織及幼苗鹽臨界濃度，對已轉化的愈傷組織及幼苗進行篩選和幾項重要生理指標的鑒定。評價轉BADH和CMO基因玉米耐鹽堿的能力。取得的主要研究結果如下： 1．進一步優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導的玉米愈傷組織轉化條件。 以普通玉米自交系H99和P<,2>的胚性愈傷組織為材料，利用農(nóng)桿菌介導法將BADH和CMO基因導入玉米自交系中，研究農(nóng)桿菌轉化系統(tǒng)的優(yōu)化。結果表明，濃度(OD值)在0.5-0.6左右，侵染25分鐘時的愈傷組織的侵染效

4、果最好，轉化率達到4.0％。 2．利用農(nóng)桿菌介導法把BADH和CMO基因轉入玉米，獲得了轉基因植株。 將轉化的愈傷組織進行分化出苗后進行PCR、Southern雜交，證明外源目的基因已整合到玉米基因組中。 3．利用花粉管通道法把BADH和CMO基因轉入玉米，獲得了轉基因植株。 采用了花粉管通道法對玉米自交系進行遺傳轉化。將抗鹽基因轉入玉米自交系030、吉農(nóng)201和父本1中，并從中得出花粉管通道法的最佳轉化

5、條件。用SSC溶解的質(zhì)粒，導入間隔時間要在8-20小時范圍內(nèi)，并且導入質(zhì)粒的濃度為500μg/mL、導入量為200μl 即可達3.3％的轉化率，通過轉化植株后代的PCR、Southern雜交分析，證明了抗鹽基因已整合到受體植株的基因組中，并在后代中得以表現(xiàn)。 4．確定玉米愈傷組織鹽篩選臨界濃度為32mmol/L，幼苗鹽篩選臨界濃度為1.0％。 5．對轉BADH和CMO基因幼苗耐鹽性相關生理指標進行了鑒定所測的耐鹽性生理指