無選擇標(biāo)記基因的抗蟲轉(zhuǎn)基因植物研究.pdf

1、目前，幾乎所有的植物遺傳轉(zhuǎn)化都要使用選擇標(biāo)記基因，諸如抗生素或除草劑抗性基因等來篩選轉(zhuǎn)化子，雖然仍無直接研究結(jié)果表明選擇標(biāo)記基因影響人類健康或環(huán)境安全，但近年來人們對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性的擔(dān)心卻與日俱增。為了消除轉(zhuǎn)基因食品的安全性顧慮，無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)運而生。結(jié)球甘藍在我國蔬菜周年供應(yīng)中占有重要地位。菜青蟲、小菜蛾等害蟲是甘藍生產(chǎn)的主要障礙之一，常造成甘藍的大幅度減產(chǎn)或品質(zhì)下降。但迄今為止，通過常規(guī)育種方法選育抗蟲的蔬菜新品種尚未取得

2、重大進展，鑒于基因工程在農(nóng)作物品種改良方面取得的巨大成功，通過轉(zhuǎn)基因途徑向甘藍等蔬菜導(dǎo)入抗蟲基因成為大家關(guān)注的焦點。大豆kunitz蛋白酶抑制劑(SKTI)是一種主要存在于大豆種子中的蛋白酶抑制劑。通常認(rèn)為這種蛋白酶抑制劑的生理功能是作為儲藏蛋白，調(diào)節(jié)內(nèi)源蛋白酶的活性，以及保護種子不受昆蟲和病原菌的侵害等，是一種天然的抗蟲物質(zhì)。更為重要的是，現(xiàn)已證實蛋白酶抑制劑轉(zhuǎn)入食用作物中，對人畜沒有副作用。因此，將該蛋白酶抑制劑作為抗蟲目的基因并結(jié)

3、合無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的抗蟲轉(zhuǎn)基因甘藍將有利于消費者的接受。 本研究采用目前在植物抗蟲基因工程中廣泛使用的大豆胰蛋白酶抑制劑(SKTI)基因為抗蟲目標(biāo)基因，除草劑基因Bar基因作為篩選標(biāo)記基因，為了便于Bar基因的剔除，在構(gòu)建連鎖表達載體的同時，將Bar基因表達盒置于兩個同向lox位點間。將含Cre基因的植物表達載體plus-cre，對得到的抗蟲植株進行二次轉(zhuǎn)化，將重組酶基因Cre引入；或單獨轉(zhuǎn)化煙草、甘藍，在開花時通過有性

4、雜交的手段將重組酶基因引入而實現(xiàn)Bar基因剔除的目的。存在于植株中的Cre基因及相應(yīng)的篩選標(biāo)記可通過花期自交分離的方法去除，最終獲得僅含抗蟲目的基因的轉(zhuǎn)基因植株。主要研究結(jié)果包括以下幾個方面： 1.甘藍高頻再生—轉(zhuǎn)化體系的建立 甘藍(鐵頭金剛)種子在無菌操作臺內(nèi)播種于1/2MS固體培養(yǎng)基中發(fā)芽，以發(fā)芽6～7d(依具體發(fā)芽情況而定)的下胚軸為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的NAA(0.1～0.2mg/L)與BA(1

5、.0～3.0mg/L)的激素組合，篩選芽分化的最佳培養(yǎng)基。結(jié)果表明：下胚軸芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+3.0mg/LBA+0.1mg/LNAA，所形成的甘藍不定芽在MS基本培養(yǎng)基或MS附加不同濃度NAA上均能生根，在MS+0.1mg/LNAA的培養(yǎng)基中，生根較快，6～7d后即分化出不定根。 為了測定外植體對卡那霉素(kanamycin，kan.)的敏感性，在篩選出的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中附加不同濃度的kan.(0、5、10、15、20、

6、30mg/L)，對下胚軸外植體進行培養(yǎng)，結(jié)果5mg/Lkan.即可有效抑制甘藍下胚軸芽分化，此濃度用作篩選標(biāo)記基因(NPTII)甘藍抗性芽的篩選濃度。 測定外植體對草丁膦(Phosphinothricin，ppt.)的敏感性，在篩選出的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入不同濃度的ppt(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/L)，對下胚軸外植體進行培養(yǎng)，結(jié)果2.5mg/Lppt即可有效抑制甘藍下胚軸芽分化，此濃度用作篩選標(biāo)記

7、基因(BAR)甘藍抗性芽分化的篩選濃度。 2.SKTI基因的克隆、序列分析及表達載體構(gòu)建 提取大豆基因組總DNA，PCR擴增目的片段?；厥誔CR產(chǎn)物，克隆于pBluescriptSK(PSK)載體后測序。測序結(jié)果表明所得SKTI克隆片段為660bp，編碼217個氨基酸。與SangIKSong報道的SKTI-A序列進行比較，核苷酸同源性為99.8﹪，氨基酸序列同源性為100﹪。獲得的SKTI基因經(jīng)一系列中間克隆、連接后得到

8、表達載體PCABarSKTI，表達載體經(jīng)PCR、酶切鑒定驗證正確無誤后導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，用于遺傳轉(zhuǎn)化。 3.重組刪除系統(tǒng)在煙草中的功能驗證 (1)抗蟲基因SKTI轉(zhuǎn)化煙草 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法將SKTI抗蟲基因、Bar基因連鎖表達載體PCABarSKTI導(dǎo)入煙草中，獲得了抗蟲轉(zhuǎn)基因煙草，對轉(zhuǎn)化植株目的基因(SKTI基因)和篩選標(biāo)記基因(Bar基因)進行了PCR檢測，電泳結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株均出現(xiàn)預(yù)期的

9、目標(biāo)條帶：660bp左右的SKTI片段，600bp左右的Bar基因片段；而非轉(zhuǎn)化植株都呈陰性，證明外源基因已整合到煙草植株的基因組中。 (2)無選擇標(biāo)記基因(Bar)的抗蟲轉(zhuǎn)基因煙草獲得及檢測 通過二次轉(zhuǎn)化法將重組酶基因(Cre)導(dǎo)入上述已獲得的抗蟲轉(zhuǎn)基因煙草，將位于2個同向lox位點間的Bar基因剔除，并對其進行ppt抗性檢測，將所得煙草葉片切成小塊在ppt.10mg/L培養(yǎng)基上發(fā)芽，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)葉片可繼續(xù)再生出綠色的

10、愈傷組織或抗性芽，大多數(shù)葉片逐漸枯黃，不能產(chǎn)生愈傷組織或抗性芽，不再具備ppt抗性。取抗除草劑檢測中白化的煙草單株，含Bar基因的質(zhì)粒作為陽性對照，抗蟲轉(zhuǎn)基因煙草作為陰性對照，進行Bar基因的PCR擴增，結(jié)果只有一個單株出現(xiàn)Bar基因擴增片段，其余單株均未出現(xiàn)相應(yīng)的Bar基因條帶。證明部分轉(zhuǎn)基因煙草中Bar基因已經(jīng)成功剔除，得到了無選擇標(biāo)記基因的抗蟲轉(zhuǎn)基因煙草。 4.重組刪除系統(tǒng)在甘藍中的應(yīng)用 (1)抗蟲基因SKTI轉(zhuǎn)化

11、甘藍 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將SKTI基因?qū)敫仕{中，獲得了抗蟲轉(zhuǎn)基因甘藍，對轉(zhuǎn)化植株目的基因(SKTI基因)和篩選標(biāo)記基因(Bar基因)進行了PCR檢測，說明外源基因已整合到甘藍植株的基因組中。 (2)抗蟲轉(zhuǎn)基因甘藍(SKTI)的抗除草劑檢測 對上述3.(1)抗蟲轉(zhuǎn)基因甘藍進行離體ppt(20mg/L)抗性檢測，觀察葉片變化情況。7d后，結(jié)果顯示，非轉(zhuǎn)基因植株葉片逐漸枯黃、白化，而轉(zhuǎn)基因甘藍的葉片則仍然保持原有的綠色

12、，對ppt具有一定抗性，說明篩選標(biāo)記基因Bar基因已成功導(dǎo)入甘藍基因組中。 (3)抗蟲轉(zhuǎn)基因甘藍(SKTI)的抗蟲試驗 進一步對轉(zhuǎn)基因植株進行了離體抗蟲檢測，觀察并記錄幼蟲生長、葉片受害情況。結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)化抗蟲基因的甘藍(對照)相比，轉(zhuǎn)基因植株葉片受損程度明顯低于對照，對菜青蟲具有一定抗性，部分菜青蟲致死，部分菜青蟲生長發(fā)育受阻、延遲羽化時間。 5.重組酶(Cre)轉(zhuǎn)基因甘藍的獲得 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將

13、重組酶(Cre)基因表達載體Plus-Cre導(dǎo)入甘藍，甘藍下胚軸和子葉在分化培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2d，根癌農(nóng)桿菌(含表達載體Plus-Cre)侵染6～8min后黑暗條件下共培養(yǎng)2d，再進行抑菌培養(yǎng)6d，轉(zhuǎn)入卡那霉素篩選培養(yǎng)基(MS+3mg/LBA+0.1mg/LNAA+5mg/LKan.+250mg/LCb.)中培養(yǎng)。經(jīng)過連續(xù)幾次篩選后，逐步淘汰“假轉(zhuǎn)化體”，獲得轉(zhuǎn)基因甘藍。對轉(zhuǎn)化甘藍目的基因(Cre基因)進行了PCR檢測，證明外源基因已整合