南林895楊抗蟲轉基因研究.pdf

1、　　本研究以南林895楊葉片為材料，在建立高效組培再生體系的基礎上，采用根癌農桿菌介導法，開展了抗蟲基因蘇云金芽孢桿菌殺蟲結晶蛋白(Bt)基因和豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTⅠ)基因的遺傳轉化研究，取得的主要進展如下：1.高頻組培再生體系的建立：通過對基本培養(yǎng)基的篩選，激素種類和濃度的調整，培養(yǎng)條件的選擇等，獲得了高效分化再生培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+TDZ0.002mg/L，分化率為100﹪，每個葉盤產生大量的叢生芽，為遺傳轉

2、化工作提供了堅實的基礎；2.遺傳轉化中選擇壓的確定：所用的篩選標記基因是新霉素磷酸轉移酶(NptⅡ)基因，在遺傳轉化中采用卡那霉素作為篩選轉化植株的選擇劑。經過對比試驗，結果表明采用Kan20mg/L作為篩選時的選擇壓?！　?.遺傳轉化體系的優(yōu)化：研究了影響根癌農桿菌轉化的各個因素，得出最優(yōu)轉化條件是：預培養(yǎng)3d，菌液濃度OD6001.0～1.3左右，侵染時間20min，共培培養(yǎng)基中加AS120～200mg/L，pH調為5.8，不去除

3、CoCl2·6H2O，共培養(yǎng)溫度設為28℃，共培養(yǎng)4d。在此優(yōu)化的轉化體系下，美洲黑楊的轉化率由4.5﹪增加到28.7﹪，提高了6倍；　　4.轉抗蟲基因植株的獲得和分子檢測：在經卡那霉素嚴格篩選獲得的22株轉Bt基因和5株轉CpTⅠ基因的再生植株進行PCR檢測，結果轉Bt基因的Kanr再生植株DNA樣品中有18株呈陽性，轉CpTⅠ基因的Kanr再生植株DNA樣品中有1株呈陽性，試驗結果初步證明目的基因已被導入到美洲黑楊雜種基因組中；