抗蟲(chóng)-耐草甘膦多價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米的研究.pdf

1、玉米是大宗糧食作物，又是重要的飼料和工業(yè)原料，由于蟲(chóng)害和草害的威脅，導(dǎo)致其產(chǎn)量和質(zhì)量嚴(yán)重下降?；蚬こ痰恼Q生為玉米蟲(chóng)害和草害的防治提供了有效手段。G2-epsps基因是從草甘膦長(zhǎng)期污染的極端環(huán)境中分離的熒光假單胞菌中克隆的新基因，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。為提高耐草甘膦基因G2-epsps在轉(zhuǎn)基因玉米中的表達(dá)水平，首先對(duì)基因進(jìn)行了植物密碼子優(yōu)化，改造后的基因命名為2mG2-epsps基因，優(yōu)化后基因的G+C含量由原來(lái)的58％調(diào)整到了53％，與G

2、2-epsps基因核苷酸序列相似性為89％。為使該草甘膦抗性基因編碼產(chǎn)物正確定位于葉綠體，克隆了擬南芥的EPSPS酶的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，大小為244bp，測(cè)序結(jié)果表明該序列與已知序列的相似性為100％。BtcrylAh基因是從我國(guó)自行分離的蘇云金芽胞桿菌(Bt)菌株BT8中克隆的新型殺蟲(chóng)蛋白基因，crylAh基因的編碼產(chǎn)物對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性強(qiáng)于目前使用的crylAc或者crylAb基因。crylIe基因是本研究組克隆的另一個(gè)具有自主

3、知識(shí)產(chǎn)權(quán)的Bt殺蟲(chóng)基因，其編碼蛋白對(duì)敏感玉米螟和抗性玉米螟均有一定毒力。crylIe與crylAb和crylAc無(wú)交互抗性，將crylAh和crylIe構(gòu)建到同一表達(dá)載體中，能夠更為有效地克服現(xiàn)有Bt基因同源性高、種類單一、昆蟲(chóng)對(duì)Bt蛋白產(chǎn)生抗性等問(wèn)題，同時(shí)可望獲得抗蟲(chóng)性更好的轉(zhuǎn)基因植物。 本研究利用抗蟲(chóng)基因crylAh和耐草甘膦基因2mG2-epsps構(gòu)建了雙價(jià)植物表達(dá)載體，通過(guò)基因槍轟擊轉(zhuǎn)化玉米，以2mG2-epsps為篩選

4、標(biāo)記基因，以草甘膦異丙胺鹽作為篩選劑，獲得到了抗性較好的TO代轉(zhuǎn)化植株80株。通過(guò)對(duì)T0、T1、T2代轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)、抗蟲(chóng)生物活性檢測(cè)、田間草甘膦抗性檢測(cè)表明，共獲得了5個(gè)能夠穩(wěn)定遺傳具有抗蟲(chóng)性和草甘膦耐受性的轉(zhuǎn)基因玉米品系。同時(shí)構(gòu)建了含有BtcrylAh和crylIe基因和耐草甘膦2mG2-epsps基因的三價(jià)植物表達(dá)載體，通過(guò)基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織，以2mG2-epsps為篩選標(biāo)記基因，以草甘膦異丙胺鹽作為篩選劑，獲得T

5、0代轉(zhuǎn)化植株69株，PCR檢測(cè)結(jié)果表明：有17株已完整的整合有抗蟲(chóng)基因crylAh、crylIe和耐草甘膦基因2mG2-epsps的3個(gè)目的基因，RT-PCR分析外源基因可以正確轉(zhuǎn)錄，已獲得結(jié)實(shí)轉(zhuǎn)基因植株。三價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米的獲得為我國(guó)多基因雙抗性轉(zhuǎn)基因玉米的研究打下了基礎(chǔ)，為下一步的玉米育種提供了材料。實(shí)驗(yàn)中以2mG2-epsps基因作為篩選標(biāo)記基因，為確定其篩選時(shí)間及篩選壓力，進(jìn)行了玉米愈傷組織對(duì)不同濃度草甘膦的抗性實(shí)驗(yàn)，確定向培養(yǎng)基中