抗蟲-耐草甘膦多價轉基因玉米的研究.pdf

1、玉米是大宗糧食作物，又是重要的飼料和工業(yè)原料，由于蟲害和草害的威脅，導致其產(chǎn)量和質量嚴重下降。基因工程的誕生為玉米蟲害和草害的防治提供了有效手段。G2-epsps基因是從草甘膦長期污染的極端環(huán)境中分離的熒光假單胞菌中克隆的新基因，具有自主知識產(chǎn)權。為提高耐草甘膦基因G2-epsps在轉基因玉米中的表達水平，首先對基因進行了植物密碼子優(yōu)化，改造后的基因命名為2mG2-epsps基因，優(yōu)化后基因的G+C含量由原來的58％調(diào)整到了53％，與G

2、2-epsps基因核苷酸序列相似性為89％。為使該草甘膦抗性基因編碼產(chǎn)物正確定位于葉綠體，克隆了擬南芥的EPSPS酶的葉綠體轉運肽序列，大小為244bp，測序結果表明該序列與已知序列的相似性為100％。BtcrylAh基因是從我國自行分離的蘇云金芽胞桿菌(Bt)菌株BT8中克隆的新型殺蟲蛋白基因，crylAh基因的編碼產(chǎn)物對鱗翅目害蟲的殺蟲活性強于目前使用的crylAc或者crylAb基因。crylIe基因是本研究組克隆的另一個具有自主

3、知識產(chǎn)權的Bt殺蟲基因，其編碼蛋白對敏感玉米螟和抗性玉米螟均有一定毒力。crylIe與crylAb和crylAc無交互抗性，將crylAh和crylIe構建到同一表達載體中，能夠更為有效地克服現(xiàn)有Bt基因同源性高、種類單一、昆蟲對Bt蛋白產(chǎn)生抗性等問題，同時可望獲得抗蟲性更好的轉基因植物。 本研究利用抗蟲基因crylAh和耐草甘膦基因2mG2-epsps構建了雙價植物表達載體，通過基因槍轟擊轉化玉米，以2mG2-epsps為篩選

4、標記基因，以草甘膦異丙胺鹽作為篩選劑，獲得到了抗性較好的TO代轉化植株80株。通過對T0、T1、T2代轉基因植株的分子檢測、抗蟲生物活性檢測、田間草甘膦抗性檢測表明，共獲得了5個能夠穩(wěn)定遺傳具有抗蟲性和草甘膦耐受性的轉基因玉米品系。同時構建了含有BtcrylAh和crylIe基因和耐草甘膦2mG2-epsps基因的三價植物表達載體，通過基因槍轟擊法轉化玉米愈傷組織，以2mG2-epsps為篩選標記基因，以草甘膦異丙胺鹽作為篩選劑，獲得T

5、0代轉化植株69株，PCR檢測結果表明：有17株已完整的整合有抗蟲基因crylAh、crylIe和耐草甘膦基因2mG2-epsps的3個目的基因，RT-PCR分析外源基因可以正確轉錄，已獲得結實轉基因植株。三價轉基因玉米的獲得為我國多基因雙抗性轉基因玉米的研究打下了基礎，為下一步的玉米育種提供了材料。實驗中以2mG2-epsps基因作為篩選標記基因，為確定其篩選時間及篩選壓力，進行了玉米愈傷組織對不同濃度草甘膦的抗性實驗，確定向培養(yǎng)基中