棉花抗草甘膦基因的表達及功能鑒定.pdf

1、草甘膦是一種廣譜滅生性、內吸傳導型的優(yōu)秀除草劑。其毒性機制主要是競爭性抑制莽草酸途徑中的EPSPS合酶，導致莽草酸途徑中斷，芳香族氨基酸合成受阻，從而擾亂生物體的正常氮代謝最終導致生物體死亡。它具有結構簡單、生產成本低、除草效果好、低毒無殘留等特點，是目前世界上使用面積最廣的除草劑品種。但作為一種非選擇性除草劑，它對農作物同樣具有滅生性作用，這大大限制了草甘膦在農業(yè)生產中的應用范圍。近年來，由于抗草甘膦轉基因農作物的大規(guī)模推廣，使得其施

2、用更加方便，也為草甘膦的應用發(fā)展開辟了新的途徑。目前已經商品化的抗草甘膦轉基因作物主要來源于美國孟山都公司。我國在該領域的研究起步較晚，目前還沒有自主研發(fā)的抗草甘膦作物品種進行商品化生產。因此，尋找擁有自主知識產權的草甘膦抗性基因，盡快培育出高產優(yōu)質的抗草甘膦作物新品種將是研究的重點內容。 本研究利用從高抗草甘膦的棉花自然突變株中克隆的抗草甘膦基因，通過構建原核載體pET-HW199，轉化工程菌株BL21(DE3)，誘導蛋白的表

3、達；通過構建植物表達載體pBIHW199，利用農桿菌介導的遺傳轉化方法，將該基因導入煙草中，以鑒定此基因能否賦予植物對草甘膦的抗性功能。為作物的抗草甘膦基因工程提供優(yōu)良的基因源。 1.用HindⅢ、SacⅠ從載體pUCHW199上切下1.4kb的目的基因，連接到原核表達載體pET-32a(+)上，構建重組子pET-HW199，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經IPTG進行誘導表達，再用SDS-PAGE電泳檢測蛋白。結果表明，該目

4、的基因在大腸桿菌中得到了表達，并且在37℃，誘導5小時蛋白表達量達到最大。 2.用EcoRⅠ從載體pUCHW199上切下1.3kb的目的基因片段，連接到植物表達載體pBI121上，構建重組子pBIHW199，利用農桿菌介導的葉盤轉化方法轉化煙草NC89，通過卡那霉素的篩選，獲得了54株T0再生植株。對得到的再生植株提取DNA，進行PCR擴增，結果表明，所得到的54株抗性植株中有13株轉進了外源抗草甘膦基因，對其作進一步的Sout