草甘膦抗性候選基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、草甘膦是是由美國孟山都公司開發(fā)的在世界農(nóng)業(yè)中具有跨時代意義的一種高效、低毒、廣譜、內(nèi)吸的非選擇性滅生除草劑，其市場化應(yīng)用不僅提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)率，為農(nóng)民帶來了極大便利，也改變了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展方向。草甘膦通過莖葉吸收后傳導(dǎo)到植物各部位能有效防除絕大多數(shù)一年生及多年生雜草，但由于其具有廣譜和非選擇性的特點，在殺死雜草的同時對農(nóng)作物也具有毒害作用?？共莞熟⒆魑锏姆N植，不僅能夠使草甘膦有效防除雜草，提高勞動生產(chǎn)力，降低種植成本，同時能夠保護(hù)作物免受

2、草甘膦的傷害，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。因此，抗草甘膦基因的挖掘和篩選對抗草甘膦作物新品種的培育具有重要意義。
　　 從抗草甘膦微生物中分離抗性基因并轉(zhuǎn)入作物中是培育抗草甘膦品種的一個十分重要的途徑。本研究從受草甘膦極端污染的污泥中篩選到一株高抗草甘膦真菌串珠狀赤霉（Gibberella moniliformis），對其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定、生物學(xué)分類和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，構(gòu)建了菌株的基因組文庫，首次分離到抗草甘膦基因EPSPS，并經(jīng)原核表達(dá)

3、驗證其具有抗草甘膦功能。同時分離出aroM基因，并對其各組成基因進(jìn)行草甘膦誘導(dǎo)后的熒光定量表達(dá)分析，旨在為培育轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物提供抗性基因資源。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用瓶培養(yǎng)富集技術(shù)，將一株抗草甘膦濃度高達(dá)600 mM的真菌從生產(chǎn)草甘膦工廠排污口的污泥中篩選出，此菌株被命名為ND-H。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、18S rDNA序列多樣性分析和5.8S rDNA-ITS序列多樣性分析，將ND-H鑒定為串珠狀赤霉（

4、Gibberella moniliformis）。采取稱干重法測定菌株隨時間變化和不同培育條件下的生長量，表明其在液體培養(yǎng)基中的對數(shù)生長期為24 h-84 h，最適生長溫度為28℃，最適環(huán)境pH值為7.0。
　　 2.用CTAB法提取并純化了菌株ND-H的基因組DNA，構(gòu)建基因組文庫，原始文庫滴度為2.25×106cfu/mL，庫容為2.25×106 cfu，插入片段范圍為1 kb-3 kb，主要集中在1 kb附近，經(jīng)鑒定文庫質(zhì)

5、量符合建庫標(biāo)準(zhǔn)，可用于抗性基因篩選。成功篩選到EPSPS基因，系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)化研究表明該基因?qū)儆贓PSPSⅠ型基因（草甘膦天然敏感型EPSP合酶）。
　　 3.將EPSPS轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，使大腸桿菌對草甘膦的抗性從原來的40 mM提高到80 mM，高于空質(zhì)粒陰性對照，這說明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后在其體內(nèi)表達(dá)成功，提高了大腸桿菌對草甘膦的抗性。
　　 4.克隆得到了串珠狀赤霉aroM基因，核苷酸序列長度為4