可變鹽單胞菌中草甘膦抗性EPSP合酶新基因克隆、大腸桿菌表達及其抗性機制的研究.pdf

1、從被草甘膦極度污染的土壤中分離到一株極端抗草甘膦菌HTG7.它能在900mmol/L草甘膦的限制性培養(yǎng)基Mops上生長.表型及16S rDNA鑒定其為可變鹽單胞菌.從可變鹽單胞菌HTG7構(gòu)建的粘?；蚪M文庫中克隆到一個完整的基因,能恢復(fù)EPSP合酶缺陷型菌株E.coli ER2799在限制性培養(yǎng)基中的生長能力,并能在草甘膦濃度為80mmol/L的Mops液體培養(yǎng)基中良好生長.基因全長1350個堿基對,核苷酸序列與目前已報導(dǎo)的編碼EPSP

2、合酶的aroA基因幾乎沒有任何同源性,氨基酸序列與草甘膦抗性相關(guān)的美國專利所涉及的22種微生物EPSP合酶的同源性在46﹪以下.利用生物信息學(xué)方法,對編碼產(chǎn)物進行亞細胞定位,還對其保守結(jié)構(gòu)域、蛋白水解酶的切割位點、蛋白的二級結(jié)構(gòu)、疏水區(qū)及跨膜區(qū)進行分析預(yù)測,所有結(jié)果表明我們所克隆的是一個結(jié)構(gòu)新穎、功能明確并高抗草甘膦的新基因.該基因已在GenBank中注冊,登錄號為AY573186.新基因與pET-28a(+)構(gòu)建了N-端帶有His·T

3、ag和T7·Tag的融合蛋白表達載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3),30℃能誘導(dǎo)可溶表達.SDS-PAGE顯示表達物分子量為51kD;蛋白通過鎳離子螯合柱得到了純化.Western Blot表明經(jīng)純化的蛋白可以與檢測試劑盒中的抗體特異結(jié)合.酶活實驗證明表達產(chǎn)物有EPSP合酶的活性.為了尋找EPSP合酶中某些與草甘瞵抗性相關(guān)的位點,利用錯誤傾向PCR技術(shù),對可變鹽單胞菌HTG7的EPSP合酶基因進行隨機PCR擴增,通過EPS