人NKp46基因克隆及其在大腸桿菌中的表達.pdf

1、一、目的:自然殺傷(NK)細胞來源于骨髓，主要存在于血液和淋巴樣組織，約占外周血淋巴細胞的5％-10％，通過NK細胞表達的特殊標記很容易與其它型淋巴細胞區(qū)分。NK細胞屬于淋巴細胞譜系細胞群，是天然免疫反應的重要效應因子。NK細胞無需抗原刺激，就能殺傷腫瘤細胞或病毒感染細胞。NK細胞介導的細胞毒作用依賴于多個表面受體/配體的相互作用。 NK細胞表面存在許多受體。特別是有兩類顯著不同的受體，通過結合MHCⅠ類分子或未知配體，來負責調

2、節(jié)NK細胞的活性，它們是免疫球蛋白樣NK細胞受體(自然殺傷抑制性受體(KillerInhibitoryReceptors，KIR)、自然殺傷細胞毒受體(NaturalCytotoxicityReceptors，NCRs)、白細胞免疫球蛋白樣受體(leukocyteimmunoglobulinlikereceptor，LILR)、p75/AIRM1等)和C型凝集素樣NK細胞受體(CD94/NKG2，NKG2D，NKp80，NKRP1，等)

3、。這些受體顯著的特征是通過抑制或者激活而精確調節(jié)NK細胞的功能。 抑制性受體信號是通過胞質內的免疫受體酪氨酸抑制基序(ImmunoreceptorTyrosine-basedInhibitoryMotifs，ITIM)介導的?；谑荏w/配體間相互作用，ITIM募集特異性磷酸酶(SHP-1，-2)，酪氨酸被磷酸化，這將導致胞內激活級聯(lián)反應的抑制。許多抑制性受體(KIR，CD94/NKG2，Ly49和LILR)可識別MHCⅠ類分子，

4、這些受體以同源分布型被所有NK細胞所表達；它們與HLAⅠ類等位基因不同類別分子的相互作用使得正常細胞免于NK細胞溶解，這是由于此作用導致了自然細胞毒作用的抑制。NK淋巴細胞只殺傷那些轉化為腫瘤或病毒感染細胞，已知它們部分地或全部地喪失了MHCⅠ分子表達能力。這些觀點基于經(jīng)過小鼠和人類實驗數(shù)據(jù)證實的“missingself”假設。NK細胞不能溶解表達自身MHCⅠ分子的正常組織，而NK細胞的觸發(fā)通過非MHC限制性激活性受體介導來實現(xiàn)。

5、 激活性受體通過藕聯(lián)在胞內區(qū)包含免疫受體酪氨酸活化基序(ImmunoreceptorTyrosineActivatingMotifs，ITAM)的分子，如CD3ζ，F(xiàn)cεRIγ和DAP-12，來轉導信號。而ITAM是通過磷酸化之后p72syk和ZAP70胞質PTK來實現(xiàn)轉導活性信號的。NK細胞表達三種不同的能直接參與自然細胞毒作用的激活性受體，稱為自然細胞毒受體(NCRs)，它們是NKp46，NKp44和NKp30。 NCRs

6、屬于免疫球蛋白超家族(Ig-SF)，顯示有一個或兩個Ig-樣胞外區(qū)，在穿膜區(qū)通過含有ITAM分子轉導激活信號。特別說明的是，每個NCRs的交聯(lián)都會導致三個結果：p56lck與p59fyn的激活、NCRs關聯(lián)多肽的酪氨酸磷酸化以及p72syk和ZAP70胞質PTK的活化?！敖换プ饔谩惫δ艿拇嬖谝驳玫浇诎l(fā)現(xiàn)的支持，單個NCR的接合能夠激活信號轉導途徑，其它NCR再由此導致NCR介導激活信號的放大。這些NK細胞所特有的表面受體，協(xié)同或增效參

7、與NK細胞激活作用溶解靶細胞。 NKp30基因位于人類染色體6q21.32，編碼一個30kD的糖蛋白，胞外區(qū)有1個IgV樣結構域，在穿膜區(qū)與CD3ζ分子藕聯(lián)。NKp30在人類靜息及激活的NK細胞細胞表面均表達。NKp44基因位于人類染色體6q21.1，編碼蛋白胞外區(qū)帶有1個IgV樣結構域，而在穿膜區(qū)含有一個賴氨酸，可能參與藕聯(lián)KARPAP/DAP12分子。NKp44在靜息的NK細胞上不表達，但能選擇性的表達在經(jīng)IL-2誘導的NK

8、細胞上。 NKp46是由Sivori等于1997年利用一種能激活NK細胞溶解作用的單克隆抗體識別出一種46kD的細胞表面分子，并命名為p46。這種分子缺乏N端連接糖，只表達在靜息和激活NK細胞上，而不表達在T細胞或B細胞上。除了細胞溶解作用外，這一單克隆抗體介導的關聯(lián)反應還誘導胞內鈣離子的增加和生成細胞因子。通過篩查人NK細胞cDNA文庫，Pessino克隆出NKp46或叫LY94的cDNA，屬于免疫球蛋白超家族，能與其他激活性

9、受體(如LY95等)協(xié)同作用。 NKp46是參與NK細胞細胞毒作用最主要受體之一。NKp46的特征是胞外區(qū)有兩個Ig樣C2型結構域，在穿膜區(qū)與酪氨酸磷酸化的CD3ζ和FcεRIγ交聯(lián)。NKp46的這兩個IgC2結構域的全部結構排列類似于白細胞免疫球蛋白受體-1(LIR-1，LIR-2或LILRB1)和KIR2D免疫受體。即使NKp46、LIR-1和KIR2D在結構排列上相似，但是在LIR-1和KIR2D中負責HLA結合的氨基酸并

10、不保存在NKp46中。例如，KIR2DL2結合HLA-Cw3的區(qū)域位于D1D2中間鉸鏈區(qū)，而NKp46相應區(qū)域并不存在這些氨基酸。這就提示推定的NKp46配體結合位點可能位于顯著不同于中間鉸鏈區(qū)的某個分子區(qū)。而且，這可能是NKp46,像其它NCR一樣，不結合經(jīng)典MHCI類分子實驗證據(jù)的更進一步的解釋。到目前為止，鑒定的NKp46配體只有流感病毒血凝素和副流感病毒血凝素-神經(jīng)氨基酶。但有關NKp46的特異性細胞配體尚未可知；要進一步研究發(fā)

11、現(xiàn)人NKp46的相關配體，需要認識NKp46細胞受體的結構及其識別特異性，從分子水平了解NK細胞生物學功能。該研究采用基因工程的方法構建了人NKp46表達載體，并獲得純化的重組蛋白，為尋找人NKp46相應細胞配體做前期工作。 二、方法和結果 1.人NKp46基因克隆及序列分析 根據(jù)GeneBank報道人NKp46基因序列，設計擴增成熟人NKp46基因的上、下游引物，分別在5'端加上限制性酶切位點Ncol和EcoR

12、I。設計上游引物時，在成熟人NKp46編碼序列上游加上起始密碼子ATG，同時上游加上保護性堿基TA，下游加上CG，降低G+C含量，防止二級結構的形成，提高重組蛋白質的表達含量。 取正常人新鮮外周血，提取單個核細胞，用本室配制RNA純化試劑盒分離純化細胞總RNA。以RNA為模板，隨機六聚體核苷酸為引物，在M-MLV逆轉錄酶作用下進行反應，合成cDNA第一條鏈。 取逆轉錄產(chǎn)物為模板，以P1P2為引物，用TaqDNA聚合酶，進

13、行PCR，擴增人NKp46基因。用低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離純化PCR擴增產(chǎn)物后，與pMD18-T載體連接，轉化入大腸桿菌DH5α，接種于含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)平板上。用菌落PCR和限制性酶譜分析篩選出陽性克隆。采用ABI3100-AvantGeneticAnalyzer基因分析儀進行測序，結果顯示，克隆的基因和預期的成熟人NKp46基因完全一致，成功構建了NKp46重組質粒pMD18-T-hNKp46。 2.人N

14、Kp46基因在大腸桿菌中的表達及重組蛋白的鑒定 用EcoRⅠ和NcoⅠ分別雙酶切重組載體pMD18-T-hNKp46和空載體pET30a(+)，再用1％瓊脂糖凝膠電泳分離純化，獲得目的基因片段hNKp46DNA及質粒載體。利用T4DNA連接酶將基因片段hNKp46DNA與酶切處理載體pET30a(+)連接，使其插入到T7lac啟動子的下游，構建表達重組子pET30a(+)-hNKp46。 將連接產(chǎn)物轉化入非表達載體大腸桿

15、菌感受態(tài)細胞DH5a，然后接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)平板上37℃過夜培養(yǎng)。利用菌落PCR，初步篩選陽性重組子。挑選陽性克隆，接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液37℃搖床過夜培養(yǎng)。采用樹脂法小量提取質粒，然后用HindⅢ和BglⅡ雙酶切鑒定，確定定向插入的陽性克隆。 準備表達宿主菌株BL21(DE3)感受態(tài)細胞，然后用經(jīng)無菌水稀釋表達重組質粒1μl(約1ng)，轉化入BL21(DE3)，接種于含有卡那霉素LB培養(yǎng)平板上，37℃過夜培

16、養(yǎng)。從新鮮培養(yǎng)平板中挑取單克隆菌落，將含有pET30a(+)-hNKp46的BL21(DE3)表達宿主菌株(工程菌株)接種于含卡那霉素的50mlLB培養(yǎng)液中，于37℃搖床培養(yǎng)約3小時，至對數(shù)增長期。加入誘導劑IPTG，繼續(xù)誘導培養(yǎng)3-4小時，4℃4,000rpm5分鐘離心收集菌體。 采用SDS-PAGE電泳和WesternBlotting分析重組蛋白質，用Bio-rad垂直電泳系統(tǒng)進行。AlphaInnotechAlphamag

17、erTM2200凝膠圖像掃描系統(tǒng)分析，凝膠干燥儀干燥后保存。結果顯示，重組蛋白的表觀分子量為38.5kD，和文獻報道一致。重組蛋白約占菌體總蛋白的40％。 為研究重組hNKp46的生物學活性，進行小規(guī)模的發(fā)酵。工程菌以1：100接種于含Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約0.5，加入IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4h。4℃離心收集菌體，超聲破碎，離心分離上清和包涵體，進行SDS-PAGE電泳分析顯示重組蛋白存在于包涵體中。在變

18、性劑鹽酸胍存在的條件下，利用His·Bind純化試劑盒純化重組蛋白，透析去除鹽酸胍，PEG8000濃縮目的蛋白，并行SDS-PAGE電泳分析。 三、結論 1.成功克隆了人NKp46基因，序列分析顯示，克隆的基因序列和文獻報道一致。 2.構建了成熟人NKp46的原核表達載體，獲得穩(wěn)定表達的工程菌株，重組蛋白約占菌體總蛋白的40％。 3.初步摸索優(yōu)化了重組hNKp46的表達條件。 4.獲得純化后的重組