鰻弧菌毒力相關基因fatA的克隆及其在大腸桿菌中的表達.pdf

1、鰻弧菌是海洋魚類弧菌病(一種高致死性的出血性敗血癥)主要病原體之一。本研究通過分子克隆、基因重組技術，在體外將鰻弧菌(Vibrioanguillarum)毒力的主要決定因素、同時也是鐵離子轉運載體系統(tǒng)中的主要成分——外膜蛋白FatA(OM2蛋白)的編碼基因fatA連接到pET-28a(+)表達載體上，而后轉化大腸桿菌BL21(DE3)，使其表達外源蛋白FatA(OM2蛋白)，進而利用表達的外源蛋白制備抗原，免疫動物，最終得到抗血清，為進

2、一步研制鰻弧菌的活載體疫苗奠定了基礎。 本實驗首先以鰻弧菌菌株MVM425為材料，利用SDS裂解法對pEIB1質粒進行提取，并以提取的質粒為模版，利用PCR擴增得到蛋白FatA的編碼基因fatA，經EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切后將其連接入pET-28a(+)表達載體中，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，并對重組子進行雙酶切鑒定以及序列測定。重組質粒經雙酶切，得到兩條片段，片段大小分別對應pET-28a(+)質粒以及PCR擴增產物。將

3、重組質粒進一步進行測序，結果顯示的堿基序列與文獻中已報道的堿基序列完全一致。編碼的蛋白質為融合蛋白，在該蛋白的C末端引入了6個組氨酸(His標簽)，利于后續(xù)蛋白純化。 將陽性重組質粒轉化大腸桿菌表達菌BL21(DE3)，用1mM的IPTG誘導目的蛋白表達，并對蛋白在菌體內的表達形式進行分析。SDS-PAGE結果顯示，與對照菌相比，經IPTG誘導后的重組菌在分子量為86KDa處有蛋白表達，該蛋白的大小與文獻中已報道的FatA蛋白的

4、大小一致。進一步分析表明，在37℃條件下經1mMIPTG誘導3h時蛋白表達量最大，并且表達的蛋白大部分是以包涵體的形式存在的。 用2M尿素對包涵體蛋白進行初步洗滌后，利用目的蛋白的多聚組氨酸尾巴進行親和層析以純化目的蛋白。將純化得到的目的蛋白經PBS透析、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒定量后，用30％的PEG8000濃縮至適當濃度，制備抗原免疫動物，以收獲抗血清，并利用得到的抗血清進行瓊脂雙向擴散以及蛋白質印跡。經瓊脂雙向擴散測得抗血

5、清的效價為1∶128；蛋白質印跡的結果顯示，在硝酸纖維素膜上特異性的顯示出了分子量為86KDa的蛋白條帶。 綜上所述，重組質粒pET-28a(+)/fatA能夠成功地在大腸桿菌BL21(DE3)中表達出外源蛋白FatA，所獲得的融合蛋白的大小與預期相同。利用親和層析純化后的該融合蛋白制備抗原，免疫動物得到的抗血清的效價為1∶128。 通過本課題的實驗，就為今后以外膜蛋白FatA為靶蛋白，將其編碼基因連接到乳酸菌特異的P1