大腸桿菌毒力島HPI相關基因缺失株的研究.pdf

1、耶爾森菌強毒力島(highpathogenicityisland，HPI)是最早發(fā)現(xiàn)于耶爾森菌中的，大小從36kb到43kb，能夠編碼攝取鐵載體耶爾森菌素(yersiniabactin，Ybt)的基因及其調節(jié)基因(irp1、irp2、fyuA)，與鐵攝取與調節(jié)有關，是表達小鼠致死表型不可缺少的遺傳單元;是決定該菌致病性和毒力的重要因素之一。我們已發(fā)現(xiàn)HPI存在于多種腸道桿菌中，如大腸桿菌、沙門氏菌、克雷伯菌等，HPI可能是通過基因的水平

2、轉移在不同種屬中分布。HPI不僅賦予病原體這樣特殊的致病力，與感染過程有關，而且在細菌進化過程中同樣扮演重要角色。為揭示HPI毒力島對大腸桿菌毒力的影響，本文做了三個方面的研究:
　　 一是利用Red重組系統(tǒng)對2株HPI+菌的這四個基因的單基因缺失株分別進行基因敲回，篩選出敲回成功的菌株。irp1、irp2、fyuA、ybtA是HPI毒力島的四個關鍵結構基因，與毒力島的毒性有著密切的關系，本實驗先合成出含有重組同源臂的這四個基因

3、的部分PCR產物，利用Red重組原理30℃表達出誘導蛋白，將該PCR產物分別與單基因缺失株重組，從而實現(xiàn)基因的互換。篩選出重組成功的菌株，由于重組成功的細菌沒有任何篩選標記，而未重組成功的細菌帶有FRT片段標記的卡納抗性，所以本實驗利用平板大量點樣的方法循序漸進的篩選出重組成功的菌株。
　　 二是比較S793103菌株4個單基因缺失株（△irp1、△irp2、△ybtA、△fyuA）與原始毒株的在鐵缺陷型培養(yǎng)基NBD培養(yǎng)基中的生

4、長趨勢，來研究它的攝鐵性變化。為了進一步研究豬源HPI+大腸桿菌毒力島相關關鍵結構基因的鐵蛋白調節(jié)功能，采用鐵缺陷型培養(yǎng)基NBD培養(yǎng)原始野生毒株和基因缺失株，通過活菌計數從而來研究它們的生長特性，培養(yǎng)原始毒株與缺失株，采用NBD培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)監(jiān)測10小時達到細菌生長穩(wěn)定期，期間觀察測量它們的吸光值OD600，繪制出生長趨勢曲線圖，比較基因敲除前后它們的攝鐵功能變化情況。結果顯示其生長速度受到了一定的影響，這表明HPI毒力島與該菌的攝鐵能

5、力相關，并且這5株菌到達生長平臺期的時間沒有顯著性差異，這提示該HPI+大腸桿菌可能還存在其他的攝鐵系統(tǒng)。
　　 三是通過動物實驗確定單基因缺失株和野生毒株對大腸桿菌毒力的影響，從而驗證了這四個關鍵基因的相關作用，為進一步研究豬源HPI+大腸桿菌奠定了堅實的基礎。對30日齡ICR小鼠進行分組，按濃度梯度分別利用這四個基因的原始野生毒株與缺失株接種小鼠，并設置陽性與陰性對照，接種后每隔12小時進行一次觀察，連續(xù)觀察7天，以改良寇氏