豬腸外致病性大腸桿菌ompX基因缺失株構(gòu)建及生物學(xué)特性研究.pdf

1、腸外致病性大腸桿菌（Extraintestinal Pathogenic E.coli，ExPEC），是一種重要的人畜共患病病原菌，主要通過其特有的毒力因子侵襲定植到人和動物腸道外組織引起疾病。近年來，本實(shí)驗(yàn)室從臨床中分離到大量豬源性ExPEC，多表現(xiàn)為多重耐藥的特性，使得抗生素的治療效果大大降低，而且由于ExPEC的致病機(jī)制尚未闡明，也缺乏有效的疫苗加以控制，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的威脅。另外，豬源ExPEC特定的毒力因子、種群、血清型與人

2、ExPEC相似，具有潛在的人類感染風(fēng)險。為有效控制豬源ExPEC的感染，篩選有效的免疫保護(hù)性抗原，研發(fā)有效的疫苗，具有重要的意義。
　　OmpX是一種重要的細(xì)菌外膜蛋白，屬于Ail蛋白家族。該蛋白在其他細(xì)菌中參與細(xì)菌對細(xì)胞的黏附和侵襲，對抗宿主的免疫防御等，且與細(xì)菌的毒力有密切關(guān)系。因此，被認(rèn)為有可能作為疫苗開發(fā)的候選靶標(biāo)。
　　本試驗(yàn)以豬源ExPEC PCN042為野生株，通過同源重組構(gòu)建ompX基因缺失株及其回復(fù)補(bǔ)償株，

3、研究其生物學(xué)特性，探討OmpX在ExPEC多重耐藥性、生物被膜和致病性中的作用。主要研究結(jié)果如下:
　　1.ompX基因缺失株及回補(bǔ)株的構(gòu)建
　　從野生株P(guān)CN042基因組擴(kuò)增ompX基因的上下游同源臂，通過重疊PCR進(jìn)行連接再與pRE112連接，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pRE112△ompX。以含有重組質(zhì)粒pRE112△ompX的x7213為供體菌，野生株為受體菌進(jìn)行雙親本結(jié)合轉(zhuǎn)移，利用質(zhì)粒上的雙向篩選標(biāo)記篩選ompX基因缺失株△

4、ompX。
　　從野生株P(guān)CN042基因組中擴(kuò)增ompX全長基因，連入穿梭載體pHSG396，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pHSG396-ompX,電轉(zhuǎn)化到△ompX缺失株，構(gòu)建回補(bǔ)株Cm△ompX。
　　2.ompX基因缺失株的生物學(xué)特性研究
　　經(jīng)PCR鑒定，本試驗(yàn)構(gòu)建的ompX缺失株在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，10代內(nèi)均可穩(wěn)定遺傳。通過測定試驗(yàn)菌株的生長曲線，證實(shí)ompX基因缺失不影響ExPEC的生長速率。
　　通過半固體培養(yǎng)

5、條件對試驗(yàn)菌株的運(yùn)動性進(jìn)行測定，結(jié)果表明，ompX基因缺失株運(yùn)動能力顯著高于野生株;經(jīng)微孔板法測定試驗(yàn)菌株的生物被膜形成能力，結(jié)果表明野生株、缺失株和回補(bǔ)株之間無顯著差異。本試驗(yàn)進(jìn)一步測定了試驗(yàn)菌株對5種抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)，結(jié)果顯示ompX缺失株對四環(huán)素和頭孢噻肟的敏感性增加。
　　本試驗(yàn)采用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)評價了OmpX對ExPEC毒力的影響。肺上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞黏附侵襲實(shí)驗(yàn)表明，ompX缺失后細(xì)菌對細(xì)胞的黏附和侵襲

6、能力均顯著下降，但對巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力并無顯著影響。體內(nèi)小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺失株的LD50為野生株的6.27倍，對缺失株進(jìn)行補(bǔ)償后LD50恢復(fù)到野生株的60％，證實(shí)ompX基因缺失可降低ExPEC的毒力;細(xì)菌載量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠感染8h和24h后，缺失株在心、肝和脾的定植能力都顯著下降，而在肺和腎的定植能力分別在感染24h和8h時顯著低于野生株。因此，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明OmpX對于ExPEC的致病性至關(guān)重要，可能成為進(jìn)一步研究ExP