豬源腸外致病性大腸桿菌比較基因組學(xué)和亞單位疫苗的研究.pdf

1、大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)是研究得最為廣泛的模式菌，按照致病性特點(diǎn)，可以分為共生型E.coli、腸內(nèi)致病性E.coli(IntraintestinalpathogenicE.coii，InPEC)和腸外致病性E.coli(ExtraintestinalpathogenicE.coli，ExPEC)。ExPEC有一些特異的毒力特點(diǎn)能使其定殖并侵襲宿主腸外組織，引發(fā)一系列感染，如尿道感染、腦膜炎、敗血癥、呼吸道

2、感染、肺炎、心內(nèi)膜炎和骨髓炎等。
　　近幾年來，豬群疫病的多發(fā)和易發(fā)，成為阻礙我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要因素。本實(shí)驗(yàn)室2004年以來從全國(guó)發(fā)病豬場(chǎng)內(nèi)患病豬腸外組織中分離了1000多株E.coli，經(jīng)過進(jìn)一步流行病學(xué)分析，結(jié)果顯示，豬源ExPEC已嚴(yán)重威脅到我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。但是目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)ExPEC類菌株的研究主要集中于人源和禽源ExPEC，對(duì)于豬源ExPEC感染不夠重視，對(duì)該類致病菌的研究報(bào)道非常少。并且目前也沒有豬源ExPEC完整

3、的全基因組序列問世。此外，E.coli的血清型眾多，且分離出的豬源ExPEC菌株常伴有高耐藥性，給豬源ExPEC感染的防控帶來了挑戰(zhàn)。因此，本實(shí)驗(yàn)室利用第二代測(cè)序技術(shù)首次得到了豬源ExPEC強(qiáng)弱毒株的完整全基因組序列，分析了其毒力因子，研究其生物學(xué)特性并闡述其強(qiáng)致病性的原因。此外，選擇了兩個(gè)保守的外膜蛋白OmpC和OmpF，作為豬源ExPEC感染的候選亞單位疫苗進(jìn)行研究分析。具體研究?jī)?nèi)容包括:
　　1.豬源ExPEC強(qiáng)毒株P(guān)CN0

4、33和弱毒株P(guān)CN061全基因組測(cè)序及分析
　　從本實(shí)驗(yàn)室臨床分離的豬源ExPEC菌株中，以小鼠為模型，篩選出強(qiáng)毒株P(guān)CN033和弱毒株P(guān)CN061，采用第二代測(cè)序技術(shù)454測(cè)序，在國(guó)際上首次得到豬源ExPEC全基因組序列。完成測(cè)序的PCN033基因組由一個(gè)長(zhǎng)度為4，987，958bp的染色體和三個(gè)長(zhǎng)度分別為3，319bp，4，086bp和161，511bp的質(zhì)粒組成;PCN061基因組由一個(gè)長(zhǎng)度為4，603，777bp的染色體和

5、六個(gè)長(zhǎng)度分別為2，014bp，5，754bp,6，222bp，34，692bp，103，644bp和145，722bp的質(zhì)粒組成。我們對(duì)PCN033和PCN061基因組進(jìn)行了較為詳盡的基因注釋，系統(tǒng)的對(duì)基因功能進(jìn)行分類和比較，預(yù)測(cè)假基因，分析基因組基本元件，包括基因組島、前噬菌體區(qū)域和插入序列等。將PCN033、PCN061和共生型E.coliHS基因組所編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行BLASTP比對(duì)，其中強(qiáng)毒株P(guān)CN033特異的編碼序列有105

6、6個(gè)。依據(jù)所選取的56株埃希氏菌中所擁有的325個(gè)核心基因，構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示PCN033和PCN061菌株在大腸桿菌中的進(jìn)化位置分別跟InPECUMN042和共生型HS菌株最近。
　　2.強(qiáng)弱毒株的比較基因組學(xué)分析
　　通過比較PCN033和PCN061的基因序列，發(fā)現(xiàn)PCN033特異的序列主要是水平轉(zhuǎn)移DNAs，其中前噬菌體區(qū)域約占50％。在這些特異性的序列中，還包括許多編碼毒力因子的相關(guān)基因，如黏附素、脂多糖、莢膜多

7、糖、鐵離子攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、分泌系統(tǒng)以及與代謝有關(guān)的基因。此外，PCN033菌株含有一個(gè)潛在的毒力質(zhì)粒PCN033p3，該質(zhì)粒含有許多典型的ExPEC毒力因子。我們將兩株菌株在以上幾個(gè)方面的差異進(jìn)行了具體的分析，歸納總結(jié)了這兩株菌毒力差異的基因型基礎(chǔ)。
　　3.強(qiáng)弱毒株生物學(xué)特性的比較分析
　　我們以BALB/c小鼠為模型，測(cè)定了強(qiáng)弱毒株的LD50分別為3.4×105和2.3×107CFUg-1，并且強(qiáng)毒株P(guān)CN033在小鼠血

8、液中的繁殖能力顯著強(qiáng)于弱毒株P(guān)CN061。此外，感染PCN033菌株的小鼠腦組織的病理切片顯示出明顯的腦膜炎病變。依據(jù)上述分析的基因型差異結(jié)果，我們鑒證了相應(yīng)的生物表型差異，包括鞭毛、運(yùn)動(dòng)性、生物被膜以及代謝能力。結(jié)果顯示，強(qiáng)毒株相比于弱毒株，能夠形成周身鞭毛，具有較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)性，形成生物被膜的能力較弱，能夠代謝較多的糖類，如蔗糖和棉籽糖。強(qiáng)弱毒株生物學(xué)特性的比較分析，從生物表型方面解釋了其毒力差異的原因。
　　4.ExPEC外膜蛋

9、白OmpC和OmpF免疫原性的研究
　　本實(shí)驗(yàn)室挑選了豬源ExPEC中兩個(gè)保守的外膜蛋白OmpC和OmpF，進(jìn)行克隆和原核表達(dá)來分析其免疫原性。純化的重組蛋白OmpC和OmpF在腹腔免疫小鼠后，產(chǎn)生了較強(qiáng)的免疫球蛋白(immunoglobulinG,IgG)抗體反應(yīng)，包括IgG1和IgG2a亞類，其中誘導(dǎo)的IgG1水平較高。免疫了OmpC和OmpF的小鼠，在感染了2.5×107CFU(5×LD50)強(qiáng)毒株ExPECPCN033后，