Caveolae介導(dǎo)腸外致病性大腸桿菌侵入腦微血管內(nèi)皮細胞的機制研究.pdf

1、腸外致病性大腸桿菌(ExPEC)是一種人獸共患病原菌，根據(jù)報道表明，其感染范圍遠遠大于其他已知的大腸桿菌，所以造成巨大損失。臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明，ExPEC是一種非常重要致中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)感染病原菌。
　　中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)是機體中密封的組織器官。通常病原微生物感染CNS的方式，主要是通過兩種途徑:第一種是通過感染鄰近組織繼而向顱內(nèi)擴散，第二種是通過血源感染，后續(xù)穿透血腦屏障造成CNS感染。其中，病原微生物穿過血腦屏障造成感

2、染是最常見的一種形式。腦膜炎是最常見的一種CNS感染，病原微生物通過粘附血管內(nèi)皮細胞進行刺激，并且促使中性白細胞進入CNS，從而來引發(fā)炎性進程。
　　內(nèi)皮細胞表面存在豐富的小窩(caveolae)，這是一種呈凹陷狀的細胞膜表面結(jié)構(gòu)，在信號傳導(dǎo)和內(nèi)吞中都發(fā)揮巨大作用。其主要成分是小窩蛋白(caveolins)和膽固醇。
　　膽固醇是小窩結(jié)構(gòu)的含量最高的組成分，小窩蛋白-1(caveolin-1)是內(nèi)皮細胞中小窩最主要的功能蛋白

3、，并且這兩種組分對于小窩結(jié)構(gòu)和功能的維持都是必要的。通過一系列體外實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)caveolin-1與不飽和長鏈脂肪酸具有高度親和力，這也表明caveolin-1可能參與小窩中膽固醇的運輸。然而，膽固醇和caveolin-1在ExPEC突破宿主血腦屏障，繼而引發(fā)機體CNS感染中的作用并不清楚。
　　本實驗通過豬源腸外致病性大腸桿菌菌株P(guān)CN033作為研究對象，采用HBMECs模擬血腦屏障(BBB)體外模型，通過檢測caveolin

4、-1在感染前后的轉(zhuǎn)錄和翻譯變化水平和相關(guān)信號通路驗證，結(jié)果表明，caveolae在PCN033入侵中具有重要作用。這也為研究新的抗ExPEC感染提供新的靶點和理論基礎(chǔ)。取得結(jié)果如下:
　　1.Caveolae存在于腦微血管內(nèi)皮細胞(BMEC)表面
　　Caveolin-1是caveolae的標(biāo)志性蛋白，本實驗通過提取HBMEC細胞的RNA并反轉(zhuǎn)錄，采用PCR檢測感染前后的caveolin-1、caveolin-2、caveo

5、lin-3基因，檢測結(jié)果顯示HBMEC中轉(zhuǎn)錄caveolin-1和caveolin-2。同時提取不同感染時間的HBMEC細胞總蛋白，檢測caveolin-1和caveolin-2蛋白變化及磷酸化。結(jié)果顯示:在HBMEC中存在caveolin中caveolin-1和caveolin-2兩種形式，并且，在細胞受到感染后主要通過caveolin-1的磷酸化發(fā)揮功能。
　　2.Caveolae在內(nèi)皮功能中的作用
　　內(nèi)皮細胞表面存在

6、豐富的caveolae結(jié)構(gòu)。本研究通過研究在血源性細菌感染中，使用caveolae的抑制劑是否會影響ExPEC侵入腦組織能力變化，和干擾以及過表達caveolin-1后ExPEC入侵HBMEC能力變化，從而探討caveolae在其中的作用。結(jié)果表明:在使用caveolae抑制劑之后，ExPEC入侵腦組織能力相應(yīng)也有下降。同時，干擾caveolin-1后，ExPEC入侵能力顯著降低;過表達caveolin-1后，ExPEC入侵能力顯著升高

7、。這說明，細菌能夠通過caveolae介導(dǎo)的內(nèi)吞穿過血管內(nèi)皮細胞從而導(dǎo)致腦膜炎，并且caveolin-1在其中起重要作用。
　　3.Caveolin的調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)分子機制
　　SREBP是膽固醇敏感器，在胞內(nèi)膽固醇含量發(fā)生變化時會進行負反饋調(diào)節(jié)，通過裂解之后入核與SRE元件結(jié)合從而負反饋調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄水平。但是對于SREBP在本實驗中的作用形式仍是未知。本研究通過采用RT-PCR的方法檢測HBMEC中SREBP三種形態(tài)轉(zhuǎn)錄水平