甲硫氨酸代謝通路對禽致病性大腸桿菌調(diào)控機制的研究.pdf

1、徐達甲硫氨酸代謝通路對禽致病性大腸桿菌調(diào)控機制的研究!甲硫氨酸代謝通路對禽致病性大腸桿菌調(diào)控機制的研究中文摘要禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(AvianpathogenicEscherichiacoli，APEC)引起的一種禽類局部或全身性傳染病，其廣泛的耐藥性和復雜的血清型，一直制約對該病的防控，并對全球的養(yǎng)禽業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。存在于革蘭氏陰性和陽性細菌中的LuxS／AI2型密度感應系統(tǒng)，可產(chǎn)生通用自誘導信號分子AI2(Auto

2、inducerAI2)。AI2可與細菌受體結(jié)合，進一步誘導胞內(nèi)相關(guān)基因的表達，最終調(diào)節(jié)自身的生理特性。AI2的產(chǎn)生涉及微生物甲硫氨酸代謝通路(Activatedmethioninecycle，AMC)，細菌可采用pfs／luxS和sah所丙種AMC代謝通路，而不同的代謝通路對APEC的調(diào)控機制以及應用甲硫氨酸代謝通路防治APEC的方法仍有待研究。本研究通過在APEC中構(gòu)建不同甲硫氨酸代謝通路，探討APEC在采用不同的甲硫氨酸代謝通路下對

3、其致病性的影響，為研究APEC的致病機理提供基礎(chǔ)，其中阻斷或者改變APEC甲硫氨酸代謝通路的方法對APEC的診療及防控技術(shù)具有重要的應用價值。一甲硫氨酸代謝通路中l(wèi)uxS、咖和sahH基因的克隆、表達以及體外活性驗證為了驗證在禽致病性大腸桿菌DEl7株中構(gòu)建甲硫氨酸sa址玳謝通路的可行性，本研究構(gòu)建了原核表達載體pET28a1uxS，pET28apfs以及pET28asahH；可溶性分析結(jié)果表明，重組蛋EtPfs，LuxS和SahH蛋白

4、在大腸桿菌中均為可溶性表達。體外活性實驗分析結(jié)果表明，重組蛋白LuxS和Pfs同時與SAH作用后可產(chǎn)生400岬ol／L的同型半胱氨酸(Homocysteine，HCY)，而在相同條件下SahH蛋白只能催化SAH產(chǎn)生473pmol／L的HCY。本研究成功獲得了具有生物催化活性的Pfs、LuxS和SahH蛋白，驗證了在DEl7內(nèi)構(gòu)建sahH循環(huán)途徑的可行性，為后續(xù)研究AMC通路對APEC致病性的影響奠定基礎(chǔ)。二APEC中不同甲硫氨酸代謝通路

5、的構(gòu)建為了在APEC中構(gòu)建不同的甲硫氨酸代謝通路，本研究成功構(gòu)建阻斷pfs／luxS代謝通路I拘DEl7△pfs。由于APEC不具備sah玳謝通路，本研究構(gòu)建了銅綠假單胞菌sa辦廈基因的回復性載體pSTVsahH，并分別轉(zhuǎn)化至DEl7和DEl7邸fs中，分別得到存在忍柳躺9和sahH兩種AMC通路的互補株sahHDEl7和只存在sahH甲硫氨酸代謝通路的互補株sahHDE17Apfs。RealtimePCR檢測結(jié)果表明，sah壓基因在s

6、ahHDEl7和sahHDEl7Apfsqb成功轉(zhuǎn)錄。AI2活性檢測實驗證實，DEl7Apfs和sahHDEl7Apfs的生長過程中不產(chǎn)生AI2。與野生株徐達甲硫氨酸代謝通路對禽致病性大腸桿菌調(diào)控機制的研究TheregulationmechanismofactivatedmethioninecycleinavianpathogenicEscherichiacoliAbstractAvianpathogenicEscherichiacol

7、icancauseavarietyofdiseaseswhichgenerallyknownasaviancolibacillosisThevariedclinicalsymptomsandcomplexpathologicalchangesresutedinagreateconomiclossesinthepoultryindustryTheLuxS／AI2typequorumsensingsystemexistsingramnega

8、tiveandgram。positivebacteriawhichinvolvestheproductionofautoinducer2(AI2、ThebacterialreceptorssenseandcombinetheAI2signalingmolecules，thustheexpressionofrelatedintracellulargeneswerefurtherinducedtoregulatetheirbiologica

9、lcharacteristicseventuallyTheuptakeofAI2alsoinvolvestheactivatedmethioninecycle(AMC)TwopathwaysofAMCexistinbacteria，whichconsistsofpfs／luxSandsahHmetabolicpathwaysTheregulationmechanismofAMCwasstillunknowninAPECInthisstu

10、dy，thedifferencesonbiologicalcharacteristicswereinvestigatedthroughconstructingdifferentAMCpathwaysinAPEC，whichwillbenefitfordevelopmentofthepathogenesis，diagnosis，treatment，preventionandcontrolofAPEC(1)Cloning，expressio

11、nandactivitydetectionofLuxS，PfsandSahHinvitroInordertoverifythefeasibilityofbuildingsahHmetabolicpathwayinDE17(Serotype02)TheprokaryoticexpressionvectorsnamedpET28a—luxS，pET28apfsandpET28a。sahHwereconstructedTherecombina

12、ntproteinsPfs，LuxSandSahHwereexpressedinBL21(DE3)The400gmol／LHCYcanbeproducedaftercatalysisofSAHbytherecombinantproteinsLuxSandPfs，while327mol／LHCYbyrecombinantproteinSahH(2)ConstructionofdifferentpathwaysofAMCinAPECFore

13、vluationdifferentpathwaysofAMCinAPEC，the醉mutantstrainDE17邸fswasconstructed，andthepfs／luxSmethioninemetabolismpathwaywasblockedThecomplementaryvectorpSTVsahHwasconstructedbysahHofPseudomonasaeruginosaThentheplasmidpSTVsah