禽病原性大腸桿菌與尿道致病性大腸桿菌毒力基因相關(guān)性與體內(nèi)外表達(dá)差異及其ftsk突變株的研究.pdf

1、尿道感染(urinary tract infections，UTIs)是人類的常見疾病，40％-50％的婦女至少經(jīng)歷過一次尿道感染。迄今，尿道致病性大腸桿菌(uropathogenic Escherichia coli，UPEC)是所有尿道感染中最常見的病原體。UPEC通過攜帶的毒力因子黏附并侵入宿主，突破宿主防御系統(tǒng)，引起組織損傷和宿主炎性反應(yīng)。UPEC在腸道外的生長能力使得它們能導(dǎo)致包括尿道感染在內(nèi)的各種疾病。禽大腸桿菌病是全部或部

2、分由禽病原性大腸桿菌(avian pathogenic Escherichia coli，APEC)引起的局部或全身性感染。與UPEC類似，APEC在禽類也有廣泛的致病潛能?；谶@種廣泛的致病潛能，UPEC和APEC被歸為新型致病性大腸桿菌——腸道外病原性大腸桿菌(extraintestinal pathogenic Escherichia coli，ExPEC)。由于APEC和UPEC在腸道外感染中可能面臨宿主相似的挑戰(zhàn)，它們可能具有

3、某些相似的致病基因和致病能力。很多研究證明，APEC和UPEC的毒力因子之間存在著一定的相似性。 本研究在收集本地區(qū)UPEC分離株的基礎(chǔ)上，探明本地區(qū)UPEC的流行病學(xué)及其耐藥性情況，比較本地區(qū)UPEC和APEC分離株的種系發(fā)生型、毒力基因型的相似性；選擇代表性APEC、UPEC分離株感染實(shí)驗(yàn)小鼠和雞，通過DNA芯片技術(shù)和相對定量反轉(zhuǎn)錄PCR測定受試毒力基因在體內(nèi)的表達(dá)水平，從而揭示APEC、UPEC毒力基因在同一宿主體內(nèi)的表達(dá)

4、規(guī)律，最終為弄清APEC與UPEC是否作為對方毒力基因貯庫這一關(guān)鍵問題提供依據(jù)。研究結(jié)果將加深我們對APEC、UPEC毒力基因的形成、分布、演化規(guī)律的理解，強(qiáng)化我們對APEC作為UPEC毒力基因貯庫這一推斷的認(rèn)識，為深入研究UTIs和禽大腸桿菌病的致病機(jī)理和特異防制措施奠定基礎(chǔ)。 1.江蘇部分地區(qū)UPEC分子流行病學(xué)與耐藥性研究從江蘇部分地區(qū)尿道感染臨床病例中分離、鑒定出202個(gè)UPEC分離株。對分離株的血清型、種系發(fā)生型、毒力

5、基因型、耐藥性以及毒力因子與耐藥性間的關(guān)系作了研究。分離株最常見的血清型為O1，其它主要血清型還有O6、O7、O15、O18、O26和O25；種系發(fā)生型中，D和B2型最為常見，分別占受試分離株的42％和38％，而A和B1型分別占13％和7％。在受檢的38個(gè)毒力基因中，fimH和feoB的檢出率超過90％；50％以上的分離株至少攜帶papA、papC、papEF、papG、KpsMTⅡ、ompT、iutA、fyuA、traT、irp-2這

6、10個(gè)基因中的一種。在黏附素中，P菌毛相關(guān)基因檢出率僅次于fimH;在保護(hù)素中，莢膜形成相關(guān)基因kpsMT檢出率較高：而三種毒素基因出現(xiàn)的頻率相當(dāng)。分離株耐藥性較強(qiáng)，多重耐藥現(xiàn)象普遍。在供試的14種抗生素中，UPEC分離株對11種抗生素的耐藥率均超過了50％，其中，對萘啶酮酸、氨芐西林和美洛西林的耐藥率均達(dá)到了90％以上；對磺胺甲基異噁唑的耐藥率達(dá)到73％，遠(yuǎn)高于國外報(bào)道；對頭孢西定、呋喃妥因、氯霉素的敏感性相對較高，其耐藥率分別為22

7、％、23％、36％；按美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)方法手冊，受試的202個(gè)UPEC分離株均為多重耐藥菌株。表明受檢地區(qū)UPEC的耐藥情況相當(dāng)嚴(yán)重，供試的抗生素已不適合作為受檢地區(qū)抗尿道感染臨床使用首選藥物。本研究結(jié)果還表明，頭孢噻肟、頭孢西定、氯霉素和呋喃妥因抗性菌株，相對于其敏感菌株毒力有下降的趨勢，其中呋喃妥因抗性菌株與其毒力下降之間的關(guān)系為首次報(bào)道。 2.APEC與UPEC毒力基因及其在體內(nèi)外表達(dá)差異的比較以我國自行分離的

8、APEC和UPEC菌株為對象，對其血清型、種系發(fā)生型、毒力基因型及其毒力基因在體內(nèi)外表達(dá)規(guī)律等方面的相似性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明二者在血清型、種系發(fā)生型、毒力基因型和毒力基因在體內(nèi)外的表達(dá)規(guī)律等方面都表現(xiàn)出很大的相似性。本研究中O1和O18血清型為UPEC分離株的優(yōu)勢血清型，而這兩種血清型在APEC分離株中也是常見的血清型。UPEC分離株的種系發(fā)生型以D和B2型最為常見，分別占受試分離株的42％和38％，其次是A和B1型分別占13％和7％

9、：而APEC分離株以A和B2為主，A型比例最高為42％，B2型次之，為36％，D型和B1型分別為12％和10％。在受檢的38個(gè)毒力基因中，檢出頻率最高的兩個(gè)基因是feoB和fimH，其在兩類菌株中的出現(xiàn)頻率都超過90％；APEC和UPEC分離株中都檢測出許多黏附素相關(guān)的基因、鐵攝取相關(guān)的基因及質(zhì)粒相關(guān)的毒力基因。SPF雞的LD50測定結(jié)果顯示UPEC代表菌株U17略低于APEC代表菌株E058，二者差異不明顯，且攻毒雞出現(xiàn)的病變相似。通

10、過DNA芯片，對兩種來源的大腸桿菌代表菌株分別在雞攻毒模型和小鼠尿道感染模型中毒力基因的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了研究。在攻毒雞體內(nèi)，APEC E058株和UPEC U17株中89％的T測試基因在表達(dá)趨勢上一致；APEC E058株在攻毒雞體內(nèi)表達(dá)水平明顯上調(diào)的5個(gè)基因(cvaC、neuC、ompT、iutA和iucCD)中，有兩個(gè)基因(cvaC和neuC)在UPEC U17株中也明顯上調(diào)，其它3個(gè)基因iutA、iucCD和ompT在UPEC U1

11、7株中也表現(xiàn)為上調(diào)趨勢；APEC E058株在攻毒雞體內(nèi)表達(dá)水平明顯下調(diào)的4個(gè)基因(aec-30、aes-8、gyrB和mdh)，在UPEC U17株中也出現(xiàn)下調(diào)趨勢。在小鼠體內(nèi)，APEC E058株與UPEC U17株中82％的T測試基因在表達(dá)趨勢上一致；UPEC U17株中明顯上調(diào)的2個(gè)基因iucCD、tir和明顯下調(diào)的2個(gè)基因sta、catI在APEC E058株中也表現(xiàn)為相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)趨勢。應(yīng)用DNA芯片技術(shù)在國際上首次揭示，

12、APEC和UPEC分離株在同一感染模型中的轉(zhuǎn)錄子具有相似的表達(dá)譜。 3.檢測ompT和ftsk相對定量PCR方法的建立及其對DNA芯片檢測ompT表達(dá)水平的驗(yàn)證和對ftsk表達(dá)水平的解析本研究利用嵌合熒光(SYBR Green I)標(biāo)記，以編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶的看家基因gapA為內(nèi)參基因，建立了用于ompT和加ftsk基因表達(dá)水平解析的兩步法實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(real time quantitative reverse

13、 transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)。 4.禽病原性大腸桿菌ftsk基因突變株的構(gòu)建及其致病性鑒定運(yùn)用基因重組方法分別將卡那霉素抗性基因(kan)連接到PCR擴(kuò)增的ftsk兩端區(qū)域的2個(gè)基因片段之間，并分別插入到pBluescript Ⅱ SK(+)(pBSK)載體的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建出帶kan基因標(biāo)志的載體pBSK-F2-Kan-F1，通過PCR擴(kuò)增F2-Kan-F

14、1片段，電轉(zhuǎn)化入APEC分離株E058中，根據(jù)同源重組原理，篩選出APECE058 ftsk基因缺失突變株E058(△ftsk)。生長曲線測定結(jié)果顯示，E058(△ftsk)的生長速度低于親本菌株E058株，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明E058(△ftsk)在攻毒后6、12和24 h時(shí)血液、肝臟、脾臟和肺中的細(xì)菌數(shù)顯著少于APEC E058株。APEC E058株感染組在接種48h后，除撲殺雞外，接種雞全部死亡：而E058(△ftsk)組相應(yīng)的死亡

15、率為20％左右。因此，可以認(rèn)定ftsk為APEC E058株重要的毒力基因。 綜上所述，對江蘇部分地區(qū)UPEC的流行病學(xué)調(diào)查表明，UPEC的常見血清型為O1、O6、O7、O15、O18、O26和O25， D和B2是其最常見的種系發(fā)生型，結(jié)果與國外報(bào)道基本一致。在供試的14種抗生素中，UPEC分離株對11種抗生素的耐藥率均超過了50％，其中，對萘啶酮酸、氨芐西林和美洛西林的耐藥率均達(dá)到了90％以上；對磺胺甲基異噁唑的耐藥率達(dá)到73

16、％；分離株均為多重耐藥菌株，表明本地區(qū)UPEC的耐藥情況相當(dāng)嚴(yán)重。UPEC分離株中，頭孢噻肟、頭孢西定、氯霉素和呋喃妥因抗性菌株，相對于其敏感菌株毒力有下降的趨勢，其中呋喃妥因抗性菌株與其毒力下降之間的關(guān)系為首次報(bào)道。UPEC與APEC毒力因子及毒力基因在體內(nèi)表達(dá)差異的比較結(jié)果表明，二者無論是在種系發(fā)生型、毒力基因型還是毒力基因在體內(nèi)的表達(dá)規(guī)律上都有很大的相似性，提示我們APEC很可能是UPEC的來源或者是UPEC毒力基因的貯存庫。通過

17、建立的相對定量反轉(zhuǎn)錄PCR，對APEC E058株的ompT和ftsk基因在感染雞體內(nèi)的表達(dá)水平的解析，驗(yàn)證了DNA芯片的檢測結(jié)果是可靠的，ompT和ftsk可能是APEC的毒力因子。利用基因重組技術(shù)對APEC E058株的ftsk基因進(jìn)行了突變，測定了突變株的生長速度，并應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來評價(jià)此基因在APEC E058株對人工感染雞致病性中的作用。結(jié)果顯示，突變株生長速度低于親本株，突變株在攻毒雞的血液、肝臟、脾臟和肺中的細(xì)菌數(shù)顯著少于親