禽病原性大腸桿菌E058株iucCiucD、iucD、iucDiutA基因突變株的構(gòu)建及其致病性評價(jià).pdf

1、禽大腸桿菌病(avian colibacillosis)指部分或全部由禽病原性大腸桿菌(avianpathogenic Escherichia coli,APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病,可以引起胚胎死亡、臍炎、敗血癥、肉芽腫、卵黃性腹膜炎、全眼球炎、氣囊炎、禽蜂窩織炎、腫頭綜合征、輸卵管炎、滑膜炎及肺炎/卵黃囊感染等一系列病癥。目前,該病已成為危害養(yǎng)禽業(yè)的重要細(xì)菌病,給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴(yán)重威脅和造成重大經(jīng)濟(jì)損失。APEC有特定鐵元素

2、利用系統(tǒng)(specific iron assimilation system),這一系統(tǒng)由iucA、iucB、iucC、iucD及iutA5個基因編碼的嗜鐵體(siderophore)、氣桿菌素(aerobactin)的合成和特定的外膜蛋白受體的表達(dá)兩部分組成。本研究旨在探討氣桿菌素家族的iucC,iucD及iutA基因與致病性之間的關(guān)系,了解其突變株的生物學(xué)特性,為深入研究該病的致病機(jī)理和特異性防制措施奠定基礎(chǔ)。
　　 運(yùn)用R

3、ed重組系統(tǒng)構(gòu)建E058iucCiucD、E058iucD、E058iucDiutA基因缺失突變株。同時(shí)將含iucD完整閱讀框的pGEX-6p-1-iucD質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化E058iucD突變株,構(gòu)建E058iucD回復(fù)株ReE058iucD。
　　 Southern bbt結(jié)果顯示Zeocin和Kanamycin抗性基因在E058iucCiucD,E058iucD或E058iucDiutA質(zhì)粒中的插入是單拷貝的;RT-PCR結(jié)果表明

4、E058iucCiucD的iucC,iucD基因不能轉(zhuǎn)錄,E058iucD的iucD基因不能轉(zhuǎn)錄,E058iucDiutA中iucD,iutA基因不能轉(zhuǎn)錄,而相關(guān)基因的上下游基因的轉(zhuǎn)錄并未受影響。Aerobactin產(chǎn)生試驗(yàn)中,E058iucCiucD,E058iucD和E058iucDiutA均不能產(chǎn)生Aerobaetin,而E058和Re-E058iucD均能產(chǎn)生Aerobactin。E058iucCiucD,E058iucD和E0

5、58iucDiutA的生長速度與E058相似。體外競爭試驗(yàn)表明,E058iucCiucD競爭指數(shù)(CI)值為O.97、E058iucD為0.75、E058iucDiutA為0.82。雖然突變株和野生株體外競爭結(jié)果變化不大,但在SPF雞體內(nèi)競爭試驗(yàn)中,E058iucCiucD與E058體內(nèi)競爭24 h后心、肝、脾、肺、腎的CI值分別為0.80、0.30、0.36、0.39、0.50。E058iucD與E058體內(nèi)競爭24 h后心、肝、脾、

6、肺、腎的CI值分別為0.02、0.31、031、0.35、0.46。E058iucDiutA與E058體內(nèi)競爭24 h后心、肝、脾、肺、腎的CI值分別為0.30、0.05、0.06、0.41、0.08。突變株各臟器的CI值在0.1～1之間,說明E058iucCiucD、E058iucD及E058iucDiutA與E058相比,均輕度致弱。體內(nèi)動態(tài)分布試驗(yàn)中,E058iucCiucD攻毒24 h后在心、肝、脾、肺、腎分離到的細(xì)菌數(shù)(lg)

7、分別為4.24±0.37、4.75±0.46、4.97±0.22、4.85±0.35、4.46±0.69。E058iucD攻毒后24 h在心、肝、脾、肺、腎中的細(xì)菌數(shù)(1g)分別為2.92±0.29、4.16±0.37、4.49±0.75、4.08±0.44、3.98±0.98。E058iucDiutA攻毒后24 h在心、肝、脾、肺、腎中的細(xì)菌數(shù)(lg)分別為3.89±1.12、4.68±0.91、4.54±0.64、4.77±0.97

8、、3.74±2.17。而E058攻毒后24 h心、肝、脾、肺、腎分離到的細(xì)菌數(shù)(lg)分別為4.62±0.95、4.77±0.70、5.20±0.95、5.35±0.88、4.62±1.06。結(jié)果表明野生株E058的細(xì)菌載量明顯高于E058iucCiucD、E058iucD、E058iucDiutA。E058、E058iucCiucD、E058iucD和E058iucDiutA株的半數(shù)致死量(LD50)分別為1044、1053、1048