尿路致病性大腸桿菌ppk1基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的：大腸埃希菌是機體正常腸道菌群之一，屬于條件致病菌，主要引起腸道內(nèi)感染一腹瀉；腸道外感染一多為內(nèi)源性感染，以尿路感染（urinary tract infection，UTI）最為常見，還有膽囊炎、新生兒腦膜炎、腹膜炎、敗血癥等。引起尿路感染的大腸桿菌，以部分血清群為主，大部分是屬于O血清型，稱之為尿路致病性大腸桿菌(uropathogenic escherichia coli，UPEC)。尿路感染是臨床上最常見的感染性疾病之一，尤其

2、多見于女性，其次是老年人及兒童，并且復(fù)發(fā)率高。革蘭陰性及陽性菌均可導(dǎo)致UTI，但是尿路致病性大腸桿菌占了其中的80-90％[1]。UPEC的感染路線是非常明確的：UPEC與共生的大腸桿菌共同定居于腸道——在毒力島編碼的各種活性因子的作用下移行至尿道-膀胱-沿輸尿管上行進入腎臟，大多數(shù)感染發(fā)生在下尿路的膀胱（膀胱炎），但是也會發(fā)生上尿路感染。UPEC擁有許多不同的毒力因子，包括Afa/Dr粘附素、Ⅰ型菌毛、細(xì)胞毒性壞死因子1、α-溶血素、

3、脂多糖等，這些毒力因子在一定程度上促進了UPEC粘附、侵襲宿主細(xì)胞。其中UPEC對尿路上皮細(xì)胞的粘附能力是其致病的先決條件，其有助于UPEC附著于尿路上皮避免被尿液沖刷清除[2-3]。近幾年來，發(fā)現(xiàn)有些表面上看來是胞外菌的病原體被證明是胞內(nèi)條件性致病菌，作為UTI的主要病原菌，UPEC也位列其中[4]。UPEC能夠侵入宿主細(xì)胞以及尿道上皮組織，并在其中生存繁殖，這有助于其在宿主體內(nèi)有效擴散。另外UPEC是生物膜感染的常見病原菌，細(xì)菌感染

4、形成生物膜后，可以發(fā)揮協(xié)同作用，形成復(fù)雜有序的立體結(jié)構(gòu)，逃避免疫系統(tǒng)攻擊，具有較高程度的耐藥性，并可在生物膜解離后播散，導(dǎo)致其他系統(tǒng)的感染[5]。UPEC導(dǎo)致的尿路感染有強烈的復(fù)發(fā)傾向，通常發(fā)生在初次急性感染后的幾周或幾個月期間，尿路感染的反復(fù)發(fā)作會導(dǎo)致瘢痕腎，還可增加發(fā)生膀胱癌的風(fēng)險，加之UPEC對多種抗生素的耐藥性，給治療帶來極大的困難，尿路感染的治療已成為臨床亟待解決的難題。揭示新的毒力因子及其在尿路感染過程中的作用是現(xiàn)在的首要任

5、務(wù)。聚磷酸鹽激酶1(polyphosphate kinase1，PPK1)是某些細(xì)菌體內(nèi)負(fù)責(zé)催化ATP脫磷酸殘基形成聚磷酸鹽(polyphosphate，poly P)的一種主要激酶，其主要負(fù)責(zé)聚磷酸鹽的合成與ATP的代謝[6]。某些ppk1基因缺失的病原菌，其poly P合成量明顯減少，而且存在毒力缺陷，如生物膜形成、捕食能力、對外界不利條件的抵抗力、運動性等均有減弱[7-8]。那么尿路致病性大腸桿菌的ppk1基因缺失，是否會對其致病

6、性產(chǎn)生影響，目前并不清楚，而這也正是本文所要探求的問題。UPEC分離株 CFT073基因組測序已完成，這為我們構(gòu)建基因缺失株，進一步研究其致病的分子機制提供了可能性。
　　方法：以尿路致病性大腸桿菌（CFT073）為研究對象，利用 Red同源重組技術(shù)敲除CFT073的ppk1基因，構(gòu)建缺失株△pk1；根據(jù)革蘭染色及鏡檢觀察野生株和缺失株的形態(tài)，比較野生株、缺失株的菌落形成能力，并分別繪制出野生株、缺失株的生長曲線；以人膀胱癌上皮細(xì)

7、胞5637為體外模型，根據(jù)菌落數(shù)計算細(xì)菌的黏附率和侵襲率，比較野生株、缺失株的粘附與侵襲力；體外比較野生株、缺失株在高熱、高滲透壓及酸性環(huán)境壓力條件下，兩者的生存率變化；采用96孔板結(jié)晶紫染色法分析CFT073 ppk1基因的缺失對其生物膜形成能力的影響。
　　結(jié)果：⑴以pET28a載體為模板，利用含有同源重組臂的引物通過PCR擴增技術(shù)成功構(gòu)建具有卡那抗性1602bp大小的ppk1基因打靶片段。利用卡那霉素抗性挑選出10個克隆子進

8、行正向篩選和反向驗證。正向篩選結(jié)果顯示第1、2號克隆的PCR片段變小，與預(yù)期結(jié)果一致（1978bp）。判斷這兩個克隆為ppk1基因缺失的菌株。第1，2號克隆的反向驗證擴增無1254bp長度的PCR片段，與預(yù)期結(jié)果一致，這說明第1、2號克隆在PCR水平被驗證了ppk1基因已經(jīng)缺失。最后選取第1號克隆的正向篩選PCR產(chǎn)物，用兩側(cè)擴增引物進行測序。經(jīng)序列測序驗證可知第1號克隆為ppk1基因缺失菌株，因為第1號克隆基因組上ppk1基因ORF區(qū)域

9、按設(shè)計已完全被卡那抗性基因序列替代，而且CFT073本身的基因組序列在測序范圍內(nèi)未發(fā)生任何突變，說明成功構(gòu)建了CFT073 ppk1缺失株△pk1。⑵革蘭染色顯微鏡觀察，野生株和缺失株均為革蘭氏陰性短桿菌，并無差別。兩菌株在LB固體平板培養(yǎng)基上的菌落大小相近，形態(tài)均為乳白色、濕潤、表面光滑的圓形菌落，菌落邊緣整齊，且表面和背面一致。根據(jù)所測得的OD600值所繪制的生長曲線，可知野生株和缺失株在營養(yǎng)豐富的LB液體培養(yǎng)基中生長曲線基本一致，

10、這說明ppk1基因的缺失并不影響菌株營養(yǎng)豐富時的生長。但是ppk1基因敲除株△pk1在低營養(yǎng)的MOPS培養(yǎng)液中的生長能力較野生株明顯減弱。⑶經(jīng)吉姆薩染色后鏡下觀察比較兩者的粘附菌數(shù)，實驗結(jié)果表明△pk1對5637細(xì)胞的粘附能力較CFT073顯著減弱，提示ppk1可影響UPEC對宿主細(xì)胞的粘附能力。根據(jù)公式計算出菌株對膀胱癌上皮細(xì)胞5637的侵襲率，利用SPSS13.0對所得數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，缺失株侵襲率為（0.18±0.04）%，

11、明顯低于野生株侵襲率（0.48±0.09）%，且P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明ppk1基因的敲除明顯減弱了尿路致病性大腸桿菌CFT073的侵襲能力。⑷比較ppk1缺失株和野生株在熱刺激、高滲透壓以及酸性培養(yǎng)條件下的生存率結(jié)果顯示，ppk1基因敲除后在這些壓力條件下的生存率均明顯下降，這也表明ppk1在CFT073抵抗外界環(huán)境壓力中具有重要作用。⑸用96孔板結(jié)晶紫染色法檢測野生株與缺失株生物膜形成能力差異，結(jié)果顯示兩菌株在生物膜

12、形成穩(wěn)定之前隨著培養(yǎng)時間的延長而增強，但缺失株在各時間段的生物膜形成能力均比野生株明顯減弱。經(jīng)兩獨立樣本t檢驗分析，野生株與缺失株之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：①利用Red同源重組技術(shù)可成功敲除CFT073的ppk1基因，從而成功構(gòu)建ppk1基因缺失株△pk1。②ppk1基因?qū)τ?CFT073的形態(tài)和生長規(guī)律并無太大影響，ppk1缺失株的菌體和菌落形態(tài)以及在LB培養(yǎng)液中的生長能力與野生株一致，只是ppk1基