禽致病性大腸桿菌ybjX、pagp缺失株生物學(xué)特性及其與PhoP的相關(guān)性研究.pdf

1、PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)廣泛存在于禽致病性大腸桿菌中，其可通過調(diào)控與內(nèi)毒素(LPS)相關(guān)基因的表達(dá)誘導(dǎo)應(yīng)答基因的防御性表達(dá)。而應(yīng)答基因的表達(dá)水平與APEC的自身致病力有很大關(guān)系?？箍咕幕?AMPR)通過直接或間接修飾LPS，改變細(xì)菌的外膜結(jié)構(gòu)加強(qiáng)細(xì)菌抵抗宿主抗微生物因子的滲透能力，從而有助于對(duì)抗菌肽的抵抗。
　　本研究在前期基因芯片的基礎(chǔ)上篩選出可能與抗抗菌肽相關(guān)的基因ybjX、pagp，探究ybjX、pagp基因缺失對(duì)禽致病

2、性大腸桿菌生物學(xué)特性及兩個(gè)基因與PhoP相關(guān)性的研究。通過引物設(shè)計(jì)，PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，成功克隆出菌株中的ybjX、pagp序列并利用Red同源重組系統(tǒng)成功構(gòu)建ybjX、pagp缺失株。在此基礎(chǔ)上利用質(zhì)粒pSTV28a構(gòu)建了基因回復(fù)株。并對(duì)AE17與ybjX、pagp基因缺失株和回復(fù)株的生物學(xué)特性展開研究。在了解ybjX和pagp缺失對(duì)其生物學(xué)研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究ybjX，pagp受PhoP的調(diào)控機(jī)制、以及對(duì)陽(yáng)離子抗菌肽的抗性。具體研

3、究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.禽致病性大腸桿菌ybjX和pagp基因缺失株及回復(fù)株的構(gòu)建
　　AE17（對(duì)氯霉素和氨芐青霉素敏感）為本實(shí)驗(yàn)室保存的O2血清型禽致病性大腸桿菌菌株。本實(shí)驗(yàn)利用Red同源重組技術(shù)對(duì)分別對(duì)ybjX基因和pagp基因進(jìn)行缺失，成功構(gòu)建兩株單基因缺失株（△ybjX和△pagp）并使用低拷貝質(zhì)粒pSTV-28a對(duì)兩株基因缺失株進(jìn)行基因回復(fù)，成功構(gòu)建基因回復(fù)株CybjX、Cpagp。
　　2.ybjX和

4、pagp基因缺失其生物學(xué)特性的評(píng)價(jià)
　　本實(shí)驗(yàn)通過生長(zhǎng)曲線的測(cè)定、運(yùn)動(dòng)性能力的檢測(cè)、環(huán)境耐受試驗(yàn)和生物被膜形成能力檢測(cè)、外膜滲透性試驗(yàn)、CEF細(xì)胞黏附和入侵試驗(yàn)和LD50的測(cè)定，探索pagp和ybjX基因缺失株對(duì)APEC生物學(xué)特性的影響。在LB液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)性能ybjX基因缺失株和回復(fù)株較野生株未發(fā)生明顯改變;而相同條件下pagp基因缺失株和野生株生長(zhǎng)性能比較發(fā)生明顯改變。運(yùn)動(dòng)性能力的檢測(cè)結(jié)果表明ybjX和pagp基因的缺失未

5、能影響AE17的運(yùn)動(dòng)性能力。環(huán)境耐受試驗(yàn)表明ybjX、pagp缺失株對(duì)酸性環(huán)境的抵抗力較野生株分別降低2.2倍(p＜0.05)，4倍(p＜0.01);ybjX、pagp缺失株對(duì)堿環(huán)境的耐受力較野生株分別降低1.5倍、降低2倍(p＜0.05);ybjX、pagp缺失株對(duì)熱環(huán)境的耐受力降低10.4％(p＜0.01);pagp缺失株對(duì)熱環(huán)境的抵抗力較野生株降低19.2％;生物被膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ybjX缺失株生物被膜形成能力顯著降低是野生株的0.

6、75倍(p＜0.01);結(jié)果表明與野生株相比，pagp缺失株生物被膜形成能力顯著增強(qiáng)是野生株的1.4倍(p＜0.01)。
　　NPN試驗(yàn)考察了兩個(gè)缺失株的細(xì)胞外膜滲透性。結(jié)果表明這兩個(gè)基因的缺失都能使APEC外膜滲透性增強(qiáng)。對(duì)APEC突變株的抗生素最小抑菌濃度和滲透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果較吻合。外膜滲透性較高的菌株對(duì)多粘菌素B和AVBD2表現(xiàn)出的敏感性較高。
　　本試驗(yàn)通過對(duì)CEF細(xì)胞黏附和入侵能力的比較、LD50的測(cè)定探索了ybjX和

7、pagp基因缺失株對(duì)APEC致病力的影響。對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞的黏附和入侵結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ybjX缺失株對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞的黏附、入侵能力能力與野生株相比分別降低了2.3倍、2倍(p＜0.01);pagp缺失株對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞的黏附、入侵能力能力與野生株相比均升高了1.3倍(p＜0.01)（而互補(bǔ)株的黏附入侵能力則恢復(fù)到野生株水平）。半數(shù)致死量檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)7日齡羅曼雞的半數(shù)致死量檢測(cè)結(jié)果表明ybjX和pagp缺失株對(duì)雞的致病力均下降

8、。
　　3.禽致病性大腸桿菌ybjX和pagp基因與PhoP蛋白的相關(guān)性分析
　　重組BL21-pET32a/phoP表達(dá)重組蛋白鑒定分子量為42.9KDa與其理論分子量相一致。并對(duì)表達(dá)的蛋白通過Ni-NTA親和層析柱純化進(jìn)行純化。
　　在Genbank上查找APEC O1血清型的ybjX和pagp基因序列，利用Promoter prediction網(wǎng)站，預(yù)測(cè)ybjX、pagp兩個(gè)基因?qū)?yīng)的啟動(dòng)子序列，利用EMSA驗(yàn)證

9、PhoP蛋白是否能夠結(jié)合上述兩個(gè)基因的啟動(dòng)子。研究結(jié)果顯示ybjX、pagp受phop蛋白的間接調(diào)控。
　　4.AE17與ybjX和pagp缺失株對(duì)陽(yáng)離子抗菌肽抗性的比較
　　本研究比較野生株、ybjX和pagp缺失株對(duì)多粘菌素B、AVBD2的敏感性。記錄抑菌圈的直徑結(jié)果表明兩個(gè)缺失株對(duì)多粘菌素B、AVBD2的抵抗能力都顯著降低。
　　通過以上實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建APEC ybjX和pagp單基因缺失株，結(jié)果顯示ybjX和pa

10、gp基因的缺失對(duì)CEF細(xì)胞和機(jī)體致病力均下降。證明了PhoP調(diào)控子對(duì)ybjX和pagp不能直接調(diào)控;ybjX和pagp缺失使AE17對(duì)抗菌肽的敏感性增強(qiáng)。初步證明了這些基因在禽致病性大腸桿菌中極可能參與抵抗宿主的先天性免疫防御，對(duì)生長(zhǎng)代謝等的調(diào)控，如脂多糖的合成，細(xì)胞膜的形成以及藥物敏感性等。研究結(jié)果表明ybjX和pagp基因?qū)PEC的致病力及對(duì)抗菌肽的抵抗具有重要的影響，為深入研究APEC抵抗宿主先天性免疫防御機(jī)理奠定一定的研究基礎(chǔ)