禽致病性大腸桿菌E058株compT、pompT基因突變株的構建及其致病性評價.pdf

1、禽致病性大腸桿菌E058株compT、pD印丁基因突變株的構建及其致病性評價ConstructionofcompTpompTknockoutmutantsofinavianpathogenicEcoliE058andevaluationtheirpathogenicity本文受國家自然科學基金資助(31272559)研究生：陳娟專業(yè)：獸醫(yī)碩士導師：高崧教授戴亞斌研究員揚州大學獸醫(yī)學院2016年5月2揚州大學碩士畢業(yè)論文E058A50％c

2、ompT、E058A50％pompT無抗突變株作為親本株，構建pTargetFFRT重組質粒，利用OverLapPCR擴增引入點突變的同源重組片段compTD97H、compTS99I、pompTD97H、pompTS99I，電轉化入帶有pCas質粒的親本株中，測序篩選出E058compTD97H、E058compTS99I、E058pompID97H、E058pompTS99I點突變株。生長曲線的測定結果顯示缺失突變株、點突變株和野生

3、株E058在生長速度上沒有顯著差異。魚精蛋白抑制試驗結果顯示E058A50％pompT：：cat、E058A100％pompT：：cat、E058pompTD97H、E058pompTS99I突變株與野生株生長趨勢一致，而E058A50％compT：：cat、E058AlOO％compT：：cat、E058compTD97H、E058compTS99I生長受到抑制，說明compT所編碼的cOmpT具有水解魚精蛋白的功能。熒光定量PCR結

4、果顯示在E058中compT和pompT基因表達量差異不顯著。隨后我們分別將包含啟動子區(qū)域完整ORF的eompT基因序列和帶有compT啟動子區(qū)域完整ORF的pompT基因序列插入到pACYCl84質粒，成功構建回復株ReE058A]00％compT：：carl、ReE058A100％compT：：eat2，進行魚精蛋白抑制試驗結果發(fā)現兩個回復株都能回補到野生株水解魚精蛋白的水平。體內動態(tài)分布試驗結果表明，與野生株E058相比，突變株E

5、058A100％compT：：cat、E058A50％pompT：：cat毒力均顯著致弱，而突變株E058A50％compT：：cat、E058AlOO％pompT：：cat并未表現致弱。進一步通過熒光定量PCR結果分析發(fā)現兩個毒力相關基因iucD和艦c在E058A50％compT：：cat表達量均顯著高于E058A100％eompT：：eat。LDso試驗結果顯示，有抗突變株E058A50％pompT：：eat較野生株E058致病性下

6、降lO倍，無抗突變株E058A50％pompT致病性并沒有下降。針對這一現象，我們將帶有pompT啟動子區(qū)域50％pompTFRT基因序列插入到pACYCl84質粒，獲得回復株ReE058A50％pompT：：eat，但其LD50結果顯示并沒有回補到野生株水平；突變株E058A50％compT：：cat、E058AlOO％pompT：：cat致病性沒有減弱，E058A100％pompT：：eat較野生株E058致病性下降lO倍與體內定居