林麝肺源致病性大腸桿菌部分耐藥基因檢測及crl毒力基因缺失株的構(gòu)建.pdf

1、林麝肺炎和化膿性疾病是林麝規(guī)模化養(yǎng)殖中的主要疾病之一，無論發(fā)病率還是致死率都比較高，它一直以來都嚴(yán)重地阻礙著人工養(yǎng)麝業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。林麝肺源致病性大腸桿菌（Lung Pathogenic Escherichia coli，LPEC）是引起該病的重要病原菌之一。本文對實(shí)驗(yàn)室前期分離鑒定的29株林麝LPEC開展了以下研究:采用玻片凝集反應(yīng)法進(jìn)行了林麝LPEC的O血清型鑒定;采用PCR擴(kuò)增方法檢測了29株林麝LPEC包括磺胺類、喹諾酮類、β

2、-內(nèi)酰胺酶類、氨基糖苷類和四環(huán)素類共五大類抗生素的20種耐藥基因;采用九-Red同源重組方法構(gòu)建了林麝LPEC O78菌株的crl毒力基因缺失株（LPEC O78-crl-），并比較分析了野生菌株LPEC O78與缺失株LPECO78-crl-在生化特性、生長曲線、半數(shù)致死量(LD50)、病理組織切片以及紅細(xì)胞凝集能力等方面的基本生物學(xué)特性差異。最終得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1、林麝LPEC O血清型鑒定及部分耐藥基因的PCR檢測<

3、br>　　29株林麝LPEC中O血清型定型的有16株菌，分別屬于9個不同的血清型，其中O78為主要血清型，占定型菌株的43.75％(7/16)。耐藥基因的PCR檢測結(jié)果顯示:29株林麝LPEC皆攜帶多種耐藥基因，20種耐藥基因中共檢測出15種耐藥基因，其中磺胺類的sul1、sul2和sul3基因，喹諾酮類的aac(6')-Ib和qnrB基因，β-內(nèi)酰胺酶類的blaTEM和blaCTX-M基因，氨基糖苷類的aac(3)-lia和ant(3

4、)-la基因及四環(huán)素類的tet(B)基因具有較高檢出率，分別為:100％、96.55％、96.55％、100％、86.21％、100％、65.52％、100％、96.55％和58.62％。UPGMA建樹分析結(jié)果顯示:O血清型與耐藥基因的檢測情況沒有明顯的相關(guān)性。
　　2、林麝LPEC O78 crl毒力基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究
　　經(jīng)PCR擴(kuò)增測序鑒定，本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的crl毒力基因缺失株LPEC O78 crl-中

5、crl基因已被成功敲除。通過生化實(shí)驗(yàn)以及生長曲線的測定，證實(shí)crl毒力基因缺失不改變LPEC O78的基礎(chǔ)代謝，對其生長速率影響不明顯。半數(shù)致死量(LD50)測定結(jié)果顯示:crl毒力基因缺失株LPEC O78-crl-的LD50為3.2×109 CFU，野生株LPEC O78的LD50為4.5×108 CFU，與野生菌株LPEC O78相比crl毒力基因缺失株LPEC O78-crl-毒力下降約7倍。觀察野生株和crl毒力基因缺失株對小