鴨源致病性大腸桿菌耐藥性研究.pdf

1、禽大腸桿菌病是家禽最常見(jiàn)的細(xì)菌病之一，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。禽大腸桿菌病(Avian Colibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大腸桿菌(Avian Pathogenie Escheichia coli，APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病。包括大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌肉芽腫(Hjarre 氏病)、氣囊病(慢性呼吸道病，CRD)，禽蜂窩織炎、腫頭綜合癥、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及臍炎/卵黃囊感染。抗菌

2、藥在控制大腸桿菌感染方面發(fā)揮了重要作用，但隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥株尤其是多重耐藥菌株不斷出現(xiàn),大腸桿菌的耐藥問(wèn)題己成為影響人類(lèi)健康和養(yǎng)殉業(yè)發(fā)展的重要因素。因此，對(duì)大腸桿菌耐藥性進(jìn)行調(diào)查研究，從基因水平上探討耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制以及指導(dǎo)臨床用藥都具有重要的意義。 1.鴨源致病性大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析 2007年2～12月間，從四川、重慶部分地區(qū)養(yǎng)鴨場(chǎng)采集發(fā)生大腸桿菌病的病死鴨的內(nèi)臟，無(wú)菌處理病料表

3、面,采用常規(guī)三區(qū)劃線(xiàn)分離細(xì)菌。通過(guò)鏡檢、生化試驗(yàn)，共得到65株鴨致病性大腸桿菌。用大腸桿菌O血清型多因子血清及單因子血清，采用玻板和試管凝集試驗(yàn)，對(duì)所分離得到的菌株進(jìn)行O血清型鑒定。分離的65株致病性大腸桿菌(E.col i)中鑒定出49株的血清型，占分離菌株的75.％，另外15株未能定型，3株自凝。這些定型菌株覆蓋了15個(gè)血清型，但以078，021，01，093等4個(gè)血清型檢出率最高，共鑒定出26株，占定型菌株的53％。檢測(cè)結(jié)果表明：

4、078，021，01，093等血清型為四川、重慶鴨源性大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型。另外血清型鑒定檢出率較低的還有11個(gè)分離株，占定型菌株的47％。從不同地區(qū)分離得到的菌株的血清型種類(lèi)和主要血清型有所不同，078血清型在大部分地區(qū)的分離菌株中都是主要血清型。采用世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的K-B紙片擴(kuò)散法，按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS的判定標(biāo)準(zhǔn)，以ATCC25922標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌做對(duì)照，選用21種常用抗生素對(duì)分離得到的65株鴨大腸桿菌

5、進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，鴨源大腸桿菌分離株耐藥現(xiàn)象已經(jīng)很?chē)?yán)重，細(xì)菌的多重耐藥十分普遍，最多耐藥20種，耐10種藥物以上的有53株(占81.5％)．在21種抗菌素中，對(duì)林可霉素和紅霉素的耐藥率最高，達(dá)96.5％,對(duì)得福平、磺胺異噁唑、氨芐青霉索、磺胺甲基異噁唑、阿莫西襪、四環(huán)素、鏈霉素等藥物的也表現(xiàn)出很高的耐藥性，耐藥率均超過(guò)了70％。妥布霉素抑菌作用最強(qiáng)，敏感株占73.8％。對(duì)不同地區(qū)的耐藥情況進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離自不同地區(qū)的受試菌

6、株對(duì)藥物的耐受情況不同。 2.鴨源致病性大腸桿菌耐藥基因及Ⅰ型整合子酶的PCR檢測(cè) 抗菌藥物是臨床治療大腸桿菌病的重要手段，長(zhǎng)期應(yīng)用與不合理使用使得藥物效糶不盡理想。本研究參照GenBank中耐藥基因相關(guān)序列，設(shè)計(jì)引物,對(duì)耐氨基糖營(yíng)類(lèi)藥物相關(guān)基因aphA、rpsL、rrsA，耐β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物相關(guān)基因bla-TEM、SHV，耐磺胺類(lèi)藥物相關(guān)基因Dhps，耐喹諾酮類(lèi)藥物相關(guān)基因gyxA、pazC，Ⅰ型整合酶int Ⅰ等進(jìn)行

7、了PCR擴(kuò)增。對(duì)本次分離的65株鴨致病性大腸桿菌進(jìn)行藥物抗性基因的分子流行病學(xué)檢測(cè)，結(jié)果表明：gyrA、pazC陽(yáng)性率最高，達(dá)到100％；aphA、Dhps，rpsL的陽(yáng)性率超過(guò)80％，分別為95.4％，90.8％和80％；rrsA-TEM和SHY的陽(yáng)性率較低，分別為13.8％，46.2％和27.7％。多數(shù)菌株攜帶有多種耐藥基因，一個(gè)菌株同時(shí)攜帶3種以上耐藥基因的有64株，占到了全部測(cè)試菌株的98.5％，最多的攜帶了8種被檢測(cè)的耐藥基因

8、，大多數(shù)攜帶了3至5種耐藥基因。對(duì)分離菌株的intⅠ的檢測(cè)表明，int Ⅰ陽(yáng)性檢測(cè)率達(dá)78.5％。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在四川、重慶部分地區(qū)養(yǎng)鴨場(chǎng)，感染鴨的大腸桿菌的耐藥性與相關(guān)耐藥基因的檢出率基本呈正相關(guān)，說(shuō)明獸醫(yī)臨床上的日益嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象與耐藥基因的普遍存在有著很大的關(guān)系，并提示控制禽源耐藥細(xì)菌對(duì)食品安全及人類(lèi)健康有重要意義。 3.鴨源致病性大腸桿菌熱休克蛋自70mRNA的研究 采用熱休克誘導(dǎo)法分別給予質(zhì)控菌株ATcc25

9、922、耐藥菌株非致死性的高溫(42℃)恒溫振蕩培養(yǎng)，先在37℃，180rpm恒溫振蕩培養(yǎng)2h，再在42℃培養(yǎng)3h，收集菌體。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)鴨大腸桿菌HSP7OmRNA的表達(dá)情況。(1)質(zhì)控菌株ATCC25922在37℃下培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)hsp70mRNA的表達(dá)，而溫度提高到42℃后，hsp70mRNA有較高表達(dá)；受試菌YYl在37、42℃培養(yǎng)，hsp7OmRNA均有較高表達(dá)。(2)采用Bio-rad Quant