鴨源致病性大腸桿菌耐藥性研究.pdf

1、禽大腸桿菌病是家禽最常見的細菌病之一，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。禽大腸桿菌病(Avian Colibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大腸桿菌(Avian Pathogenie Escheichia coli，APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病。包括大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌肉芽腫(Hjarre 氏病)、氣囊病(慢性呼吸道病，CRD)，禽蜂窩織炎、腫頭綜合癥、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及臍炎/卵黃囊感染。抗菌

2、藥在控制大腸桿菌感染方面發(fā)揮了重要作用，但隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥株尤其是多重耐藥菌株不斷出現(xiàn),大腸桿菌的耐藥問題己成為影響人類健康和養(yǎng)殉業(yè)發(fā)展的重要因素。因此，對大腸桿菌耐藥性進行調(diào)查研究，從基因水平上探討耐藥性產(chǎn)生的分子機制以及指導(dǎo)臨床用藥都具有重要的意義。 1.鴨源致病性大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析 2007年2～12月間，從四川、重慶部分地區(qū)養(yǎng)鴨場采集發(fā)生大腸桿菌病的病死鴨的內(nèi)臟，無菌處理病料表

3、面,采用常規(guī)三區(qū)劃線分離細菌。通過鏡檢、生化試驗，共得到65株鴨致病性大腸桿菌。用大腸桿菌O血清型多因子血清及單因子血清，采用玻板和試管凝集試驗，對所分離得到的菌株進行O血清型鑒定。分離的65株致病性大腸桿菌(E.col i)中鑒定出49株的血清型，占分離菌株的75.％，另外15株未能定型，3株自凝。這些定型菌株覆蓋了15個血清型，但以078，021，01，093等4個血清型檢出率最高，共鑒定出26株，占定型菌株的53％。檢測結(jié)果表明：

4、078，021，01，093等血清型為四川、重慶鴨源性大腸桿菌的優(yōu)勢血清型。另外血清型鑒定檢出率較低的還有11個分離株，占定型菌株的47％。從不同地區(qū)分離得到的菌株的血清型種類和主要血清型有所不同，078血清型在大部分地區(qū)的分離菌株中都是主要血清型。采用世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的K-B紙片擴散法，按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS的判定標(biāo)準(zhǔn)，以ATCC25922標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌做對照，選用21種常用抗生素對分離得到的65株鴨大腸桿菌

5、進行藥敏實驗，結(jié)果顯示，鴨源大腸桿菌分離株耐藥現(xiàn)象已經(jīng)很嚴(yán)重，細菌的多重耐藥十分普遍，最多耐藥20種，耐10種藥物以上的有53株(占81.5％)．在21種抗菌素中，對林可霉素和紅霉素的耐藥率最高，達96.5％,對得福平、磺胺異噁唑、氨芐青霉索、磺胺甲基異噁唑、阿莫西襪、四環(huán)素、鏈霉素等藥物的也表現(xiàn)出很高的耐藥性，耐藥率均超過了70％。妥布霉素抑菌作用最強，敏感株占73.8％。對不同地區(qū)的耐藥情況進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離自不同地區(qū)的受試菌

6、株對藥物的耐受情況不同。 2.鴨源致病性大腸桿菌耐藥基因及Ⅰ型整合子酶的PCR檢測 抗菌藥物是臨床治療大腸桿菌病的重要手段，長期應(yīng)用與不合理使用使得藥物效糶不盡理想。本研究參照GenBank中耐藥基因相關(guān)序列，設(shè)計引物,對耐氨基糖營類藥物相關(guān)基因aphA、rpsL、rrsA，耐β-內(nèi)酰胺類藥物相關(guān)基因bla-TEM、SHV，耐磺胺類藥物相關(guān)基因Dhps，耐喹諾酮類藥物相關(guān)基因gyxA、pazC，Ⅰ型整合酶int Ⅰ等進行

7、了PCR擴增。對本次分離的65株鴨致病性大腸桿菌進行藥物抗性基因的分子流行病學(xué)檢測，結(jié)果表明：gyrA、pazC陽性率最高，達到100％；aphA、Dhps，rpsL的陽性率超過80％，分別為95.4％，90.8％和80％；rrsA-TEM和SHY的陽性率較低，分別為13.8％，46.2％和27.7％。多數(shù)菌株攜帶有多種耐藥基因，一個菌株同時攜帶3種以上耐藥基因的有64株，占到了全部測試菌株的98.5％，最多的攜帶了8種被檢測的耐藥基因

8、，大多數(shù)攜帶了3至5種耐藥基因。對分離菌株的intⅠ的檢測表明，int Ⅰ陽性檢測率達78.5％。本試驗結(jié)果顯示，在四川、重慶部分地區(qū)養(yǎng)鴨場，感染鴨的大腸桿菌的耐藥性與相關(guān)耐藥基因的檢出率基本呈正相關(guān)，說明獸醫(yī)臨床上的日益嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象與耐藥基因的普遍存在有著很大的關(guān)系，并提示控制禽源耐藥細菌對食品安全及人類健康有重要意義。 3.鴨源致病性大腸桿菌熱休克蛋自70mRNA的研究 采用熱休克誘導(dǎo)法分別給予質(zhì)控菌株ATcc25

9、922、耐藥菌株非致死性的高溫(42℃)恒溫振蕩培養(yǎng)，先在37℃，180rpm恒溫振蕩培養(yǎng)2h，再在42℃培養(yǎng)3h，收集菌體。通過RT-PCR檢測鴨大腸桿菌HSP7OmRNA的表達情況。(1)質(zhì)控菌株ATCC25922在37℃下培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR檢測，沒有發(fā)現(xiàn)hsp70mRNA的表達，而溫度提高到42℃后，hsp70mRNA有較高表達；受試菌YYl在37、42℃培養(yǎng)，hsp7OmRNA均有較高表達。(2)采用Bio-rad Quant