鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌耐藥性的傳遞研究.pdf

1、鴨疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）病和大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）病是危害家禽養(yǎng)殖業(yè)最為嚴(yán)重的兩大細(xì)菌性傳染病，兩種細(xì)菌感染均可引起鴨敗血癥、纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎等。這兩種病原在臨床上常出現(xiàn)混合感染現(xiàn)象，混合感染容易發(fā)生耐藥性的水平傳遞，使得二者的耐藥譜擴(kuò)大，導(dǎo)致藥物治療失敗，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。作為細(xì)菌混合感染的耐藥性傳遞已有不少研究，但是鴨疫里默

2、氏桿菌和大腸桿菌兩個(gè)不同種屬間耐藥性的傳遞研究還沒(méi)有報(bào)道。本文篩選出耐藥性的RA和敏感性的E.coli進(jìn)行體外混合傳代培養(yǎng)，并對(duì)混合傳代培養(yǎng)后篩選到的耐藥性大腸桿菌進(jìn)行了耐藥性分析。
　　本實(shí)驗(yàn)從山東地區(qū)疑似發(fā)病鴨進(jìn)行病料收集、細(xì)菌分離鑒定共獲得鴨疫里默氏桿菌4株，采用k-B紙片法進(jìn)行了4株RA分離株及2株E.coli標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)24種常用抗生素的藥物敏感試驗(yàn)。藥敏結(jié)果顯示，4株RA對(duì)氨基糖苷類（慶大霉素、妥布霉素和卡那霉素）及喹諾酮

3、類（環(huán)丙沙星、氧氟沙星和諾氟沙星）均為耐藥，2株大腸桿菌對(duì)這6種抗生素均為敏感，根據(jù)具體數(shù)據(jù)，選擇RA P3菌株和E.coli標(biāo)準(zhǔn)株8099分別作為耐藥性轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的供體菌和受體菌，用于混合傳代培養(yǎng)。并采用試管雙倍稀釋法進(jìn)行了RA P3菌株和E.coli標(biāo)準(zhǔn)株CMCC8099對(duì)慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星和諾氟沙星最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定。
　　篩選出的RA和E.coli試驗(yàn)菌株，進(jìn)行混合傳代培養(yǎng)，因RA培養(yǎng)

4、對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件要求比較高，需摸索兩種菌混合傳代培養(yǎng)的條件。最終確定混合傳代培養(yǎng)條件：RA和E.coli先單獨(dú)培養(yǎng)；混合培養(yǎng)第一代，取10μL E.coli菌懸液（濃度為1.5×103 CFU/mL）與50μL RA菌懸液（濃度為15×108 CFU/mL）接種在4 mL含4％血清的胰蛋白胨大豆肉湯TSB培養(yǎng)基中，混合培養(yǎng)9~12 h；從混合培養(yǎng)第二代開(kāi)始，取10μL混合培養(yǎng)上一代菌液（濃度為1.5×105 CFU/mL）與50μL RA菌液

5、（濃度為15×108 CFU/mL）接種在4 mL含4%血清的TSB培養(yǎng)基中，混合培養(yǎng)9~12 h。
　　混合傳代培養(yǎng)后耐藥性大腸桿菌的篩選，吸取每一代的混合培養(yǎng)菌液涂布高于E.coli標(biāo)準(zhǔn)株8099兩倍最低抑菌濃度的麥康凱抗性篩選板，環(huán)丙沙星（0.25μg/mL）、氧氟沙星（1μg/mL）、諾氟沙星（1μg/mL）抗性板上均無(wú)菌生長(zhǎng)，卡那霉素（32μg/mL）、慶大霉素（10μg/mL）、妥布霉素（8μg/mL）抗性板上有單個(gè)菌

6、落，分別命名為E1、E2、E3。
　　混合傳代培養(yǎng)前后耐藥性分析，篩選到的大腸桿菌耐藥菌株E1、E2、E3對(duì)上述6種抗生素進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)和最低抑菌濃度的測(cè)定，與大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株8099相比，耐藥菌株E1對(duì)氨基糖苷類的慶大霉素、妥布霉素和卡那霉素敏感性顯著變化，最低抑菌濃度也顯著的增加。
　　為了進(jìn)一步研究RA與E.coli間耐藥性的水平傳遞，選取氨基糖苷類耐藥基因，氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aac6-Ⅰ及aac3-Ⅱ、氨基糖苷腺

7、苷轉(zhuǎn)移酶基因aadA1、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因aph3-Ⅱ設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法對(duì)RA P3菌株、E.coli標(biāo)準(zhǔn)株8099及篩選到的大腸桿菌耐藥株E1進(jìn)行檢測(cè)和序列測(cè)定。結(jié)果顯示，RA P3菌株及篩選的E.coli耐藥菌株E1均檢測(cè)到了基因aac6-Ⅰ，其他基因均未檢測(cè)到。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株8099未檢測(cè)到任何耐藥基因。
　　本研究對(duì)鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌成功進(jìn)行了混合傳代培養(yǎng)，同時(shí)對(duì)混合傳代培養(yǎng)前后耐藥性進(jìn)行了分析，確定了RA