間接ELISA檢測鴨疫里默氏桿菌抗體方法的建立及應用.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，簡稱RA)引起鴨的傳染性漿膜炎(Infectiousserositis)，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最重要的病原之一。在生產(chǎn)實踐中，現(xiàn)有的間接ELISA方法雖然能夠檢測出RA抗體，但不能區(qū)分是人工感染還是滅活疫苗免疫后產(chǎn)生的。本研究分別以RA菌體超聲波裂解抗原、RA脂多糖抗原、原核表達CAM融合蛋白為包被抗原建立了間接ELISA方法，并應用于人工感染RA鴨恢復期血清和滅活疫苗免疫鴨血清抗

2、體，為疫苗的研制及血清流行病學研究提供血清學檢測的手段。研究結果如下： 1.本試驗用pETCAM表達載體轉化表達宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)，用0.4mmolIPTG在30℃下誘導4小時后有最大表達量，通過WesternBlot對表達蛋白進行了鑒定及利用His·Bind親和柱層析純化獲得37kD左右的CAM融合蛋白。 2.間接ELISA方法的建立(1)本試驗以蛋白質濃度91ug/ml的菌體超聲波裂解物作包被抗原，成功

3、建立了檢測RA抗體的間接ELISA方法(PRO-ELISA)，其最適待檢血清和兔抗鴨IgG血清的稀釋倍數(shù)均為1∶800；對鴨抗多殺性巴氏桿菌、Ⅰ型鴨病毒性肝炎、大腸桿菌、沙門氏菌、鴨瘟等血清的檢測結果為陰性；阻斷試驗結果為陰性；板內(nèi)和板間變異系數(shù)分別為3.86％-16.8％、6.17％-9.46％。 (2)本試驗以多糖濃度為26ug/ml的脂多糖抗原作包被抗原，成功建立了檢測RA抗體的間接ELISA方法(LPS-ELISA)，其

4、最適待檢血清和兔抗鴨IgG血清的稀釋度分別為1∶200、1∶400；對鴨抗多殺性巴氏桿菌、Ⅰ型鴨肝炎病毒、大腸桿菌、沙門氏菌、鴨瘟病毒等血清檢測結果呈陰性；阻斷試驗結果為陰性；板內(nèi)和板間變異系數(shù)分別為4.73％-6.90％、5.30％-11.9％。 (3)本試驗以蛋白質濃度22.51ug/ml的CAM融合蛋白作包被抗原，成功建立了檢測RA抗體的間接ELISA方法(CAM-ELISA)，其最適待檢血清和兔抗鴨IgG血清的稀釋度分別

5、為1∶400、1∶200；對鴨抗多殺性巴氏桿菌、Ⅰ型鴨肝炎病毒、大腸桿菌、沙門氏菌、鴨瘟病毒等陽性血清的檢測結果呈陰性；阻斷試驗結果為陰性；板內(nèi)和板間變異系數(shù)分別為5.85％-16.3％、4.22％-9.37％。 3.間接ELISA用于人工感染RA鴨恢復期血清和滅活疫苗免疫鴨血清抗體檢測PRO-ELISA能從滅活疫苗免疫后第5天的鴨血清中檢測到抗體(P/N=7.11)；能從人工感染RA后第三天的鴨血清中檢測出抗體(P/N=6.1

6、2)，第21天抗體抗體水平達到高峰(P/N=17.26)，隨后抗體水平開始下降。 滅活疫苗免疫20天內(nèi)的鴨血清利用LPS-ELISA不能檢測到抗體(P/N＜3)，但二免后抗體水平迅速上升及第5天和第25天的抗體水平分別為4.25和9.34(P/N)。LPS-ELISA能從人工感染RA后第三天的鴨血清中檢測出抗體(P/N=4.87)，第21天抗體抗體水平達到高峰(P/N=17.04)，隨后抗體水平開始下降。 利用CAM-E