鴨疫里默氏桿菌菌蛻疫苗制備方法的研究及免疫效果的評價.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌?。ㄋ追Q鴨傳染性漿膜炎）是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起的鴨、鵝、火雞等禽類的一種高致病性、接觸性傳染病，是危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疫病之一。該病呈世界性流行，發(fā)病率和死亡率一般為10-30％，部分鴨場達95％以上。目前對于該病的治療主要依靠疫苗和抗生素，但因RA血清型多，目前使用的單價滅活疫苗并不能有效防控該病，此外，隨著RA對多種抗生素耐藥性的增加以及食品安全問題，使用抗生素防控該

2、病的弊端日益顯現(xiàn)，因此，疫苗的研制新型疫苗成為該病防控的重點。
　　 細菌菌蛻(bacterial ghost，BG)是革蘭氏陰性菌被噬菌體PhiX174的裂解基因E裂解后形成的完整細菌空殼。由于它具有完整的細菌表面抗原結(jié)構(gòu)，所以它能直接作為疫苗使用。與傳統(tǒng)的疫苗相比，菌蛻疫苗能誘導(dǎo)機體的產(chǎn)生更高水平的細胞和體液免疫，菌蛻的制備可以通過發(fā)酵的方式大量生產(chǎn)，制備的凍干疫苗可以在室溫條件下長時間保存，因此，菌蛻的研究具有廣闊的應(yīng)用前

3、景。
　　 本研究主要開展3方面的研究工作:
　　 1)溶菌質(zhì)粒的改造
　　 菌蛻是革蘭氏陰性菌在噬菌體Phix174的溶菌基因E的作用下形成的細菌空殼，通常由λpL/pR-cI857溫控系統(tǒng)通過調(diào)控E基因的表達制備。本研究通過重疊PCR技術(shù)，將λpL/pR-cI857溫控系統(tǒng)中λpR啟動子的第2個操縱基因(OR2)的第9位堿基由T突變?yōu)镃（T→C）。溶菌試驗結(jié)果表明，突變后的λpL/pR-cI857系統(tǒng)在37℃

4、時仍能穩(wěn)定抑制基因E的表達，對大腸桿菌的溶菌率為99.9％。本研究通過對λpR啟動子的改造，擴大了λpL/pR-cI857溫控系統(tǒng)的溫度調(diào)控范圍，構(gòu)建了溶菌盒(△cI857-E-rrnB)，為菌蛻疫苗的研制提供了參考。
　　 2) RA菌蛻制備方法的研究
　　 本研究對3種菌蛻的制備方法進行了研究。第一種方法:為了構(gòu)建能夠在RA中起溶菌作用的溶菌質(zhì)粒，選用大腸桿菌和RA的穿梭載體pCP29，將pCP29與本研究構(gòu)建的△c

5、I857-E-rrnB溶菌盒酶切后，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌BW19851，構(gòu)建pCP29-△cI857-E-rrnB溶菌質(zhì)粒，將該質(zhì)粒導(dǎo)入RA菌株CH3中，制備RA菌蛻;第二種方法:通過基因替換的方法，將本研究構(gòu)建的△cI857-E-rrnB溶菌盒替換掉大腸桿菌DE17的luxS基因，通過將△cI857-E-rrnB溶菌盒整合到細菌的基因組來實現(xiàn)非質(zhì)粒依賴型的菌蛻制各方法;第三種方法:利用細胞穿透肽MAP，直接作用于RA，制備RA菌蛻。

6、>　　 通過對3種菌蛻制備方法的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將構(gòu)建好的溶菌質(zhì)粒導(dǎo)入RA CH3后，未能起到溶菌作用，不能制備RA菌蛻。通過基因替換的方式將溶菌盒導(dǎo)入大腸桿菌DE17基因組后，也沒有起到溶菌效果。最后利用MAP，成功制備RA菌蛻，MAP制各RA菌蛻的條件為:用含60μM MAP的Na2HPO4溶液，稀釋RA菌體至OD600=0.4左右，21℃恒溫培養(yǎng)作用1h，加慶大霉素終止反應(yīng)，最后離心收集菌體，制備RA菌蛻疫苗。通過電鏡觀察，制備

7、的RA菌蛻，表面膜結(jié)構(gòu)保持完整，具有菌蛻所特有的空殼結(jié)構(gòu)。
　　 3) RA菌蛻疫苗的免疫效果評價
　　 為了對MAP制備的菌蛻疫苗的免疫效果進行評價，本研究對利用細胞穿透肽MAP制各的RA CH3株菌蛻疫苗，與傳統(tǒng)的甲醛滅活苗的免疫效果進行對比?？贵w水平檢測結(jié)果表明，一免10天后CH3滅活苗組及CH3菌蛻組，抗體滴度可以達到1:400，CH3滅活苗（佐劑）組及CH3菌蛻（佐劑）組，抗體滴度可以達到1:800，二免10天

8、后，CH3滅活苗組及CH3菌蛻組，抗體滴度可以達到1:1600，CH3滅活苗（佐劑）組及CH3菌蛻（佐劑）組，抗體滴度可以達到1:3200。細胞因子檢測及淋巴細胞增殖實驗結(jié)果表明，一免后，對照組與免疫組，差異不顯著;二免后，免疫組與對照組相比，差異顯著，且CH3菌蛻（佐劑）組＞CH3滅活苗（佐劑）組＞CH3滅活苗組＞ CH3菌蛻組。免疫保護實驗結(jié)果表明，加佐劑菌蛻組與不加佐劑的菌蛻組的保護率均為100％，而加佐劑的甲醛滅活疫苗組與不加佐