鴨疫里默氏桿菌phoP基因鑒定及其突變株的免疫效果評價.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）是影響我國養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴重的疾病病原之一，該病在養(yǎng)殖地區(qū)分布廣泛，感染主要引起心包炎、肝周炎和氣囊炎等，造成雛鴨生長緩慢、大批死亡嚴重制約著我國養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展。RA有21種血清型且不同血清型間交叉保護效果不好，目前市售疫苗存在一些缺陷如應用比較廣泛的油乳劑滅活苗無法提供完全保護（70％左右的保護率）且存在注射吸收不理想，毒株覆蓋不完全等問題。
　　我們利用基因工程技

2、術制備RA-CH1基因缺失活疫苗，旨在尋找一種能有效對RA進行有效減毒的疫苗株用于對該疾病的預防。本研究首先通過序列對比設計引物克隆了RA-CH1潛在的phoP基因。然后為了驗證克隆基因的正確性，我們將擴增基因片段連接到低拷貝的pYA3337質粒上，再將重組質粒導入沙門氏菌ΔphoP基因缺失株中進行功能鑒定。結果表明，RA-CH1潛在的phoP基因能夠回補沙門菌phoP基因的功能。同時，生物信息學預測結果顯示克隆的phoP基因編碼的Ph

3、oP蛋白沒有信號肽位點和跨膜區(qū)。接著，我們對RA-CH1 phoP基因進行了原核表達及多克隆抗體制備，PCR擴增phoP基因連接至表達載體pET32a后轉入Rosetta表達菌中。按照蛋白表達流程對其進行表達并優(yōu)化表達條件，將表達蛋白進行純化后免疫兔子制備多克隆抗體，瓊擴試驗測定多次免疫后兔子免疫抗血清效價比達到1∶16，這為后續(xù)研究細菌中phoP調控網絡及與蛋白間相互作用奠定了基礎。
　　我們還通過pRE112自殺質粒介導的同源

4、重組構建RA-CH1ΔphoP基因缺失株，并對其生物學特性、免疫原性和免疫保護效應進行了系統(tǒng)性的研究。根據(jù)RA phoP上下游序列設計引物，通過交疊PCR融合phoP基因同源臂并在插入Spec抗性基因，構建重組質粒pRE112-Left-Spec-Right，通過細菌結合法將重組質粒導入RA-CH1中，用卡那霉素和壯觀霉素雙抗篩選得到RA-CH1ΔphoP基因缺失株，對RA-CH1ΔphoP進行生物學特性研究:生長曲線測定表明該突變株生

5、長略慢于野生株;藥敏試驗表明缺失株對氨芐西林敏感性下降，對慶大霉素敏感性上升;測定缺失株對鴨胚成纖維粘附力與侵襲力能力發(fā)現(xiàn)與親本株無明顯差異;檢測組織載量發(fā)現(xiàn)突變株接種后12h肝臟和24h大腦中組織載量顯著低于野生株;另外，毒力試驗發(fā)現(xiàn)基因缺失株毒力減近100倍。最后，我們評估了RA-CH1ΔphoP基因缺失株的免疫原性及免疫保護效果，將疫苗株經腿部肌肉注射接種雛鴨，三周后用約150×LD50劑量同源株攻毒并記錄一個月內雛鴨的生長情況。