禽多殺性巴氏桿菌crp、phoP基因的功能研究及其突變株免疫效力的初步評(píng)價(jià).pdf

1、多殺性巴氏桿菌是能引起多種動(dòng)物致病的革蘭氏陰性菌?，F(xiàn)有研究表明，以全局調(diào)控基因crp或phoP為靶基因在大腸桿菌或沙門氏菌進(jìn)行疫苗開發(fā)研究卓有成效。然而，在多殺性巴氏桿菌中對這兩個(gè)基因的相關(guān)研究還相當(dāng)匱乏，基于此，我們的研究結(jié)果如下:
　　1、潛在基因的篩選鑒定:將潛在的多殺性巴氏桿菌crp、phoP(含兩段潛在序列，分別命名為phoP1和phoP2)基因分別克隆至低拷貝質(zhì)粒pYA3332后引入沙門氏菌相應(yīng)突變株，利用麥康凱顯色試

2、驗(yàn)成功鑒定多殺性巴氏桿菌crp基因，利用X-P平板顯色試驗(yàn)和多粘菌素B抗性試驗(yàn)確定phoP2基因?yàn)檎嬲亩鄽⑿园褪蠗U菌phoP基因。同時(shí)，制備了Crp和PhoP的兔源多克隆抗體;
　　2、突變株構(gòu)建:通過自殺質(zhì)粒pYA4278介導(dǎo)的同源重組方法，成功地構(gòu)建的禽源多殺性巴氏桿菌Pasteurella multocida DY120818株crp、phoP基因缺失株。兩基因缺失株均遺傳穩(wěn)定性良好。根據(jù)后續(xù)試驗(yàn)需要，基于大腸桿菌-巴氏桿

3、菌科穿梭質(zhì)粒pMC-express，成功地構(gòu)建P.multocida DY120818 crp基因缺失株的互補(bǔ)株;
　　3、生物學(xué)功能鑒定:多殺性巴氏桿菌缺失crp基因后，菌株的生長速度明顯減緩，對部分碳源和氨基酸代謝能力改變;表型特征（外膜蛋白和脂多糖圖譜）無明顯變化，對鴨血清的敏感性顯著升高，在雛鴨模型中通過口服途徑和滴鼻途徑攻毒，毒力分別較野生株降低了22倍和86倍;多殺性巴氏桿菌缺失phoP基因后，菌株的生長速度、代謝能力

4、、表現(xiàn)特征和血清敏感性均無明顯變化，在雛鴨模型中測定力通過口服途徑和滴鼻途徑攻毒，毒力分別較野生株降低了32倍和154倍;
　　4、免疫保護(hù)力測定:雛鴨經(jīng)滴鼻免疫P.multocida DY120818△crp株活菌，或經(jīng)口服免疫P.multocida DY120818△phoP株活菌，用野生株攻毒，分別能達(dá)到60％和54.5％的保護(hù)效力。然后，采用P.multocida DY120818野生型滅活全菌菌體或外膜蛋白分別檢測免疫后

5、雛鴨血清IgY和膽汁IgA水平，均能檢測到較強(qiáng)的體液免疫和粘膜免疫應(yīng)答水平;
　　5、轉(zhuǎn)錄組測序分析:在相同培養(yǎng)條件下，對禽多殺性巴氏桿菌P.multocidaDY120818野生型，crp和phoP基因缺失株分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，以野生型數(shù)據(jù)為對照，分別在crp、phoP基因缺失株中得到186個(gè)、334個(gè)差異表達(dá)基因;通過對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行包括GO功能注釋、KEGG通路在內(nèi)的生物信息學(xué)分析，對多殺性巴氏桿菌轉(zhuǎn)錄因子crp、ph

6、oP基因的調(diào)控功能得到初步了解。
　　總之，在本研究中，我們首次在多殺性巴氏桿菌中對全局調(diào)控基因crp、phoP基因進(jìn)行了功能鑒定，并在強(qiáng)毒株P(guān).multocida DY120818中分別構(gòu)建了crp和phoP基因突變株，鑒定了這兩個(gè)基因?qū)?xì)菌生長、生化代謝、LPS和OMPs圖譜結(jié)構(gòu)，血清敏感性和毒力等生物學(xué)功能方面的影響;測定了以上兩個(gè)基因缺失株以活菌疫苗疫苗的形式免疫雛鴨后的免疫保護(hù)效應(yīng);更進(jìn)一步地，依靠轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對基因