禽多殺性巴氏桿菌PlpB基因克隆、表達(dá)及表達(dá)蛋白生物學(xué)特性研究.pdf

1、本研究針對(duì)禽多殺性巴氏桿菌PlpB基因的克隆、表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的初步應(yīng)用開展了以下工作。 1．多殺性巴氏桿菌PipB基因的克隆與高效表達(dá)。 參照GenBank已發(fā)表的PM70菌株的PlpB基因序列，設(shè)計(jì)PMC48-1菌株的PIpB一對(duì)寡核苷酸引物。以本實(shí)驗(yàn)室保存的C48-1菌株為實(shí)驗(yàn)材料，用PCR的方法成功擴(kuò)增PlpB基因的全序列，該片段共831bp包含一個(gè)完整的編碼框。將擴(kuò)增基因插入原核表達(dá)載體pGEX-KG，成功構(gòu)建

2、了重組表達(dá)質(zhì)粒pKG-PlpB，并對(duì)pKG-PlpB重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明：擴(kuò)增序列與GenBank上所報(bào)道的PM70株的PlpB基因序列核苷酸同源性在99％以上。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)獲得大小約56KDa的表達(dá)蛋白(命名為ppB)。Western blot檢測(cè)表明，該表達(dá)蛋白具有良好的反應(yīng)原性。 2．多殺巴氏桿菌PipB表達(dá)蛋白免疫保護(hù)作用初步研究。 以表達(dá)蛋白ppB乳

3、化后免疫小鼠，連續(xù)免疫3次，第一次間隔14d，第二次間隔7d，并用瓊脂雙向擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)血清抗體效價(jià)。結(jié)果，ppB蛋白的抗血清效價(jià)達(dá)1/16；采免疫小鼠血清注入非免疫小鼠體內(nèi)，同時(shí)進(jìn)行主動(dòng)及被動(dòng)免疫保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果表明，所構(gòu)建的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pKG-PlpB在大腸桿菌BL21融合表達(dá)的蛋白ppB能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)，可保護(hù)小鼠抵抗強(qiáng)毒的攻擊，這種免疫保護(hù)作用也可通過血清被動(dòng)傳遞給非免疫小鼠，使后者獲得對(duì)強(qiáng)毒的抵抗力。 本研究是國