禽多殺性巴氏桿菌6-PGD原核表達(dá)及其初步應(yīng)用.pdf

1、禽巴氏桿菌病又稱為禽霍亂，是由多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）引起的一種急性、接觸性敗血性傳染病，對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展有著嚴(yán)重的影響。由于Pm血清型眾多，尋找新的疫苗抗原，研制新型安全、高效多殺性巴氏桿菌亞單位疫苗尤為重要。6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6-PGD）為細(xì)菌糖代謝中磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，在細(xì)菌代謝過程中通過調(diào)控5-磷酸核糖和還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的生成，進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌的生長與繁殖。通過對多殺性巴氏桿菌

2、C48-1菌株的6-磷酸葡萄糖脫氫酶的原核表達(dá)，初步建立間接ELISA檢測方法和重組蛋白免疫保護(hù)性的研究。
　　1.參照KEGG中己發(fā)表的Pm70菌株的6-PGD基因序列（登錄號：T00046），設(shè)計引物，以本實(shí)驗(yàn)室保存的C48-1菌株的全基因組模板，用PCR的方法成功擴(kuò)增出6-PGD基因的全序列，該片段長度為1453bp。將目的基因插入原核表達(dá)載體PET-28a，成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒PET-28a-6PGD。測序結(jié)果表明：擴(kuò)增

3、序列與GenBank上所報道的Pm70菌株、3480菌株、HN06菌株、ATCC43137菌株、HB03菌株同源性均達(dá)到99％。
　　2.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)目的蛋白，目的蛋白的大小約為53kD，與預(yù)期結(jié)果相符。進(jìn)一步優(yōu)化誘導(dǎo)時間，并檢測目的蛋白在37℃和16℃的可溶性。Western-blot結(jié)果表明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，為進(jìn)一步研究其免疫保護(hù)功能和間接ELISA方法的初步建立奠

4、定了基礎(chǔ)。
　　3.試驗(yàn)應(yīng)用純化的6-PGD重組蛋白為包被抗原初步建立間接ELISA檢測方法。初步優(yōu)化間接ELISA最佳反應(yīng)條件，即抗原包被濃度為10μg/mL，37℃放置2h，4℃過夜，最佳封閉液為5%脫脂奶粉，封閉時間為30min，血清稀釋度為1：200，酶標(biāo)二抗按1：60000稀釋，血清和酶標(biāo)二抗的孵育時間分別為30min和60min，批間重復(fù)和批內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)均在0.433%-7.23%，阻斷試驗(yàn)的阻斷率均大于50%

5、。
　　4.將純化后的重組蛋白和C48-1滅活全菌用白油佐劑制成疫苗免疫雞，同時設(shè)生理鹽水為陰性對照組。免疫兩次，間隔時間為兩周，用間接 ELISA方法檢測血清抗體水平。結(jié)果表明重組蛋白組的抗體水平明顯高于全菌滅活苗組和對照組。首免后第7周C48-1強(qiáng)毒株以10LD50攻毒，結(jié)果顯示：全菌滅活苗組能夠提供100%的保護(hù)，重組蛋白組保護(hù)率為60%，生理鹽水組則完全沒有保護(hù)力。
　　綜上所述：建立的間接ELISA方法可用于臨床樣