多殺性巴氏桿菌跨膜蛋白基因文庫(kù)的構(gòu)建與分析.pdf

1、多殺性巴氏桿菌是重要的畜禽病原菌,可以引起豬肺疫、牛出敗、禽霍亂等,給畜牧業(yè)造成重大損失;同時(shí)它也是人類的機(jī)會(huì)性致病菌,能夠引起人類呼吸道的多種感染或繼發(fā)感染。研究表明,PM的外膜蛋白尤其是那些只在體內(nèi)特殊條件下才表達(dá)的膜蛋白是免疫識(shí)別的主要抗原,在預(yù)防疾病中發(fā)揮重要作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)選擇可調(diào)控啟動(dòng)子的跨膜輸出蛋白選擇克隆載體pMB-Ara-T,克隆多殺性巴氏桿菌C48-19的跨膜輸出蛋白基因。我們以引物30N8和多殺性巴氏桿

2、菌C48-19基因組DNA為模板的混合物用Klenow延伸,將上述反應(yīng)混合物作為PCR反應(yīng)的模板,以O(shè)L30作為引物,進(jìn)行rPCR擴(kuò)增,擴(kuò)增出的rPCR產(chǎn)物大小集中在200bp～2000bp。將質(zhì)粒pMB-Ara-T經(jīng)XcmI酶切純化后與純化后的rPCR產(chǎn)物連接,連接產(chǎn)物純化后電轉(zhuǎn)化到感受態(tài)TG1,37℃水浴后加甘油至10％,-20℃保存。從1ml轉(zhuǎn)化液中取20ul涂布于Kan抗性平板,長(zhǎng)出300-400個(gè)克隆,估算十次轉(zhuǎn)化后組成了含有

3、2.0×105個(gè)克隆的基因組文庫(kù),菌落PCR檢測(cè)顯示文庫(kù)插入率在95％以上,片段大小集中在250bp-500bp之間。
　　 將甘油保存的文庫(kù)經(jīng)Amp+Kan+1.0％arabinose篩選共獲得333個(gè)克隆子,333個(gè)克隆再經(jīng)過Amp+Kan平板篩選得到31個(gè)克隆。序列測(cè)定、BLAST分析表明其中333個(gè)基因高度同源于多殺性巴氏桿菌Pm70中的258個(gè)基因;ORF分析、Singal P預(yù)測(cè)等結(jié)果表明,333個(gè)克隆子都含有信號(hào)肽

4、結(jié)構(gòu),片段以閱讀框?qū)ξ坏姆绞讲迦?插入片段基因和報(bào)告基因(△P△SP Amp)融合表達(dá);啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析表明258個(gè)基因中有140個(gè)含有完整的啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu),除去自主表達(dá)的31個(gè)克隆編碼的29個(gè)基因,確定剩下的111個(gè)基因的啟動(dòng)子為L(zhǎng)B培養(yǎng)條件下沉默的啟動(dòng)子,只在特殊誘導(dǎo)條件下才開放:通過對(duì)基因跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析,有178個(gè)克隆含有一個(gè)或一個(gè)以上的跨膜螺旋結(jié)構(gòu),編碼了134種基因,其余的106個(gè)克隆子一共編碼了78種需要特殊誘導(dǎo)表達(dá)