牛源多殺性巴氏桿菌交叉保護(hù)性抗原的篩選及其融合蛋白免疫效果的研究.pdf

1、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)是巴氏桿菌屬最重要的致病菌，屬于革蘭氏陰性菌，能夠感染家養(yǎng)和野生動(dòng)物，具有廣泛的宿主譜。多殺性巴氏桿菌根據(jù)莢膜血清型的不同分為A、B、D、E和F5種血清群，根據(jù)LPS抗原性的不同又可將其分為16種血清型。近年來(lái)，綜合國(guó)內(nèi)外報(bào)道我們發(fā)現(xiàn)引起肉牛多殺性巴氏桿菌病的主要血清型是A型和B型，而且A型多殺性巴氏桿菌疾病呈逐年上升趨勢(shì)。目前，預(yù)防牛源巴氏桿菌病的疫苗主要是針對(duì)B型多殺

2、性巴氏桿菌的滅活疫苗，雖然該類疫苗在控制牛源巴氏桿菌病中起到了重要的作用，但是對(duì)不同血清型的交叉保護(hù)性弱。因此，需要開(kāi)發(fā)一種安全有效，并能提供交叉保護(hù)性的新型疫苗來(lái)預(yù)防多殺性巴氏桿菌疾病，而牛源多殺性巴氏桿菌交叉保護(hù)性抗原的篩選，為該新型融合疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　目前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ompA、ompH、PlpE、pm0979、P6以及pfhB6種抗原能對(duì)單一血清型提供一定的保護(hù)率，而且，在多種血清型中保守性極高。但是，在這些成

3、分中哪些能提供交叉保護(hù)性作用還是未知。因此，本研究以這6種抗原基因作為研究對(duì)象，在相同免疫劑量與攻毒劑量的前提下，進(jìn)行了如下研究:
　　1、牛源多殺性巴氏桿菌交叉保護(hù)性抗原的初步篩選
　　以牛源A型Pm CQ2株基因組為模板，利用PCR技術(shù)對(duì)6種保護(hù)性抗原基因進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建相應(yīng)的原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21進(jìn)行表達(dá)，同時(shí)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化以及Western blot鑒定。用純化后的蛋白皮下免疫小鼠，于二免21 d

4、后，用ELISA法檢測(cè)小鼠體內(nèi)抗體產(chǎn)生情況，并用2 LD50 Pm CQ2株(4.4×105cfu)、PmB型（2.96×104 cfu）腹腔攻毒，計(jì)算小鼠存活率。結(jié)果顯示，rPM0979、rPLPE以及rOMPH三種蛋白對(duì)A型和B型多殺性巴氏桿菌均提供了良好的保護(hù)性，其中對(duì)PmA型保護(hù)率分別為40％、70％、60％，對(duì)PmB型保護(hù)率分別為30％、40％、30％。結(jié)果提示，蛋白rPM0979、rPLPE以及rOMPH具有交叉保護(hù)性，可作

5、為后續(xù)研制融合疫苗的潛在蛋白。
　　2、牛源多殺性巴氏桿菌pm0979-ompH融合基因的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的交叉保護(hù)性研究
　　通過(guò)生物信息學(xué)分析獲得pm0979、ompH基因的主要抗原表位片段，并將兩個(gè)基因片段用3種不同長(zhǎng)度的疏水性linker進(jìn)行拼接融合（標(biāo)記為pm0979-L6-ompH、pm0979-L10-ompH、pm0979-L15-ompH）。對(duì)融合基因進(jìn)行表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化及Western blo

6、t分析，最終以rPM0979、rOMPH、rPM0979-L6-OMPH、rPM0979-L10-OMPH、rPM0979-L15-OMPH蛋白免疫小鼠后進(jìn)行Pm CQ2株、PmB型攻毒試驗(yàn)，分別測(cè)定小鼠體內(nèi)抗體產(chǎn)生情況以及對(duì)小鼠的交叉保護(hù)性效果。結(jié)果顯示，表位基因表達(dá)的單一蛋白的交叉保護(hù)性與之前的全長(zhǎng)基因表達(dá)的蛋白相比較，其交叉保護(hù)性有所降低，但融合蛋白的相對(duì)來(lái)說(shuō)都有所提高;其中，融合蛋白rPM0979-L6-OMPH對(duì)Pm CQ2株

7、攻毒的小鼠保護(hù)率為60％，對(duì)PmB型攻毒小鼠保護(hù)率為20％，融合蛋白rPM0979-L10-OMPH、rPM0979-L15-OMPH對(duì)Pm A型攻毒的小鼠保護(hù)率為70％，對(duì)PmB型攻毒小鼠保護(hù)率為30％。結(jié)果提示，3種rPM0979-OMPH融合蛋白對(duì)小鼠具有良好的交叉保護(hù)性，其中融合蛋白rPM0979-L10-OMPH、rPM0979-L15-OMPH交叉保護(hù)性效果較好;同時(shí)該結(jié)果還提示，不同linker長(zhǎng)度的融合蛋白對(duì)小鼠的保護(hù)率

8、不同，而且linker的最佳長(zhǎng)度為10aa。
　　3、牛源多殺性巴氏桿菌pm0979-PlpE融合基因的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的交叉保護(hù)性研究
　　通過(guò)生物信息學(xué)分析獲得了pm0979、PlpE基因的主要抗原表位，將pm0979、PlpE基因通過(guò)長(zhǎng)度為10aa的linker相連，構(gòu)建融合基因pm0979-L10-PlpE。對(duì)融合基因進(jìn)行表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化及Western blot分析。通過(guò)小鼠試驗(yàn)評(píng)價(jià)重組蛋白rPM097